檢測中生菌素的高效液相色譜法

張楠潘忠成楊宏勃李雙雙李蒲民

(1.陜西麥可羅生物科技有限公司，陜西 渭南 714200;2.哈爾濱工程大學材料科學與化學工程學院教育部超輕材料與表面技術重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150001)

中生菌素(Zhongshengmycin)又名農抗751，屬N-糖苷類抗生素，是淺灰色鏈霉菌海南變種(Streptomyces lavendulae var heinanensis n.var)的代謝產物。對細菌、真菌及昆蟲具有活性。該產生菌是中國農業科學院生物防治研究所從海南土壤中分離得到的[1]。中生菌素有效成分為鏈絲菌素(Streptothricins)F，是由Waksman等[2]于1942年從Streptomyces lavendulae中分離到的。隨后，鏈絲菌素的其它組分(鏈絲菌素A、B、C、D、E和X)也相繼被發現，其各組分的結構中均包含一分子古洛糖胺、一分子鏈里定內酰胺和數量不等的β-賴氨酸[3,7]，見圖1。

圖1 中生菌素標準品液相色譜圖

國內目前對于中生菌素的檢測以生物測定法為主，而生物測定法在生產上因其檢測局限性及特異性較差，無法廣泛用于生產。2012年西北農林科技大學報道了液質聯用法檢測中生菌素[8]，該檢測方法精密度線性加標回收率良好，但是由于液質聯用儀價格高昂，很難在實際生產中普及。而目前國內中生菌素生產廠家達40多家，品種100多個，因此建立一個有效便捷的檢測方法很有必要。本文采用高效液相色譜法對中生菌素母藥及中生菌素可濕性粉劑中各有效成分進行定性定量分析,該方法操作簡單快速、定量分析準確，易于推廣。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀，配制DAD檢測器；Waters symetryshield RP18，粒徑5μm，150mm×4.6mm(id)不銹鋼色譜柱；中生菌素B～F標準品(西安麥斯迪生物工程有限公司提供)，各組分純度均>90%；中生菌素母藥及中生菌素可濕性粉劑(純度未知)，由福建凱立生物制品有限公司提供。試劑乙腈(色譜純，科密歐)、磷酸氫二鈉(分析純，天津致遠)、庚烷磺酸鈉(分析純，MREDA)、磷酸(分析純，富宇精細化工)、超純水(自制)。

1.2 方法描述

試樣用超純水溶解，以乙腈加水加庚烷磺酸鈉加磷酸氫二鈉加磷酸為流動相，使用反相C18為填料的不銹鋼柱和可變波長紫外檢測器(200nm)，對試樣中的中生菌素進行高效液相色譜分離和鑒定。

1.3 儀器條件

表1 儀器條件

表2 梯度程序

1.4 測定步驟

1.4.1 標準溶液配制

分別稱取含中生菌素F約0.025g、中生菌素E約0.003g、中生菌素D約0.015g、中生菌素C約0.008g、中生菌素B約0.005g(精確至0.0001g)的中生菌素標樣，置于同一50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用。

1.4.2 試樣溶液的配制

稱取含中生菌素F約0.025g(精確至0.0001g)的中生菌素試樣，置于50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜過濾，備用。

1.4.3 測定

在上述條件下，待儀器穩定后，連續注入數針標準溶液，直至相鄰兩針中生菌素峰面積相對變化小于1.2%，按照標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

1.4.4 計算

1.4.4.1 中生菌素各組分的計算

將測得的兩針試樣溶液以及試樣前后兩針標樣溶液中中生菌素的面積分別進行平均，試樣中中生菌素F(E、D、C、B)的質量分數ω1(%)按式(1)計算：

(1)

式中，ω1(2、3、4、5)為試樣中中生菌素F(E、D、C、B)的質量分數，%；A1為標樣溶液中，中生菌素F(E、D、C、B)峰面積的平均值；A2為試樣溶液中，中生菌素F(E、D、C、B)峰面積的平均值；m1為中生菌素F(E、D、C、B)標樣的質量，g；m2為試樣的質量，g；ω0為標樣中中生菌素F(E、D、C、B)的質量分數，%。

1.4.4.2 中生菌素總組分的計算

中生菌素總組分質量分數ω(%)按照式(2)計算：

ω=ω1+ω2+ω3ω4+ω5

(2)

式中，ω為中生菌素總組分的質量分數，%。

圖2 中生菌素母藥液相色譜圖

圖3 中生菌素可濕性粉劑液相色譜圖

2 方法評價

2.1 線性相關測定

根據母藥中各組分比例情況，分別配制不同濃度的標準品，分別考察了中生菌素F在濃度250～750μg·mL-1、中生菌素E在濃度22.5～90μg·mL-1、中生菌素D在濃度136.67～410μg·mL-1、中生菌素C在濃度76.67～230μg·mL-1、中生菌素B在濃度46.67～140μg·mL-1范圍內具有良好的線性關系。具體結果見表3。

表3 中生菌素各組分線性方程及相關系數

2.2 精密度測定

取中生菌素母藥樣品按照1.2中方法測定中生菌素母藥中各組分，5次計算結果見表4。供試母藥中中生菌素含量最高，為5.14%;其次是D、C、B,含量分別為3.46%、2.00%、1.39%；中生菌素E含量最低，為0.61%。由表4還可以看出,所建立的方法具有良好的精密度，中生菌素母藥中各組分的相對標準偏差均小于其所對應的Horwitz方程的計算結果。表明該方法能滿足中生菌素母藥中各有效成分的定性及定量分析。

表4 中生菌素母藥精密度測定

取中生菌素可濕性粉劑樣品按照1.2中方法測定中生菌素可濕性粉劑中各組分，5次計算結果見表5。由表5可以看出,所建立的方法具有良好的精密度，中生菌素可濕性粉劑中各組分的相對標準偏差均小于其所對應的Horwitz方程的計算結果。表明該方法能滿足中生菌素可濕性粉劑中各有效成分的定性及定量分析。

表5 中生菌素可濕性粉劑精密度測定

2.3 準確度測定(加標回收率測定)

按照母藥各組分比例，將除中生菌素各組分標品混勻，得到一個實驗室“合成”樣品，平行制得5個樣品，進行回收率測定，測定結果見表6。結果表明，在此檢測方法下平行測定5次后中生菌素F加標回收率范圍為98.23%～99.37%，在98%～102%范圍內；中生菌素E加標回收率范圍為98.76%～102.00%，在98%～102%范圍內；中生菌素D加標回收率范圍為98.29%～99.02%，在98%～102%范圍內；中生菌素C加標回收率范圍為98.03%～101.87%，在98%～102%范圍內；中生菌素B加標回收率范圍為99.90%～101.76%，在98%～102%范圍內，均符合NY/T 2887要求。

表6 中生菌素母藥準確度測定

續表 中生菌素母藥準確度測定

按照配方比例要求，將除原藥以外的所有助劑混勻，制作制劑空白。按3.0%的含量向空白中添加有效成分中生菌素，即得到一個實驗室“合成”樣品，平行制得各樣品，進行回收率測定，測定結果見表7。結果表明，在此檢測方法下平行測定5次后中生菌素F加標回收率范圍為97.19%～99.17%，在97%～103%范圍內；中生菌素E加標回收率范圍為96.79%～99.49%，在95%～105%范圍內；中生菌素D加標回收率范圍為95.06%～99.78%，在95%～105%范圍內；中生菌素C加標回收率范圍為96.70%～104.27%，在95%～105%范圍內；中生菌素B加標回收率范圍為98.96%～104.64%，在95%～105%范圍內，均符合NY/T 2887要求。

表7 中生菌素可濕性粉劑準確度測定

3 結論

本研究采用高效液相色譜法對中生菌素母藥及中生菌素可濕性粉劑中各有效成分進行檢測，以乙腈-庚烷磺酸鈉水溶液為流動相進行梯度洗脫，中生菌素母藥及可濕性粉劑各有效成分在C18色譜柱上均可達到基線分離;各有效成分的準確度和精密度均可達到農藥常量分析的要求,且在一定的濃度范圍內，線性關系良好。由于鏈絲菌素類化合物的抑菌活性與其賴氨酸的數目呈正相關關系，即賴氨酸數量越多，其抑菌活性越強，因此，中生菌素原藥中鏈絲菌素A～F均應為其活性有效成分。本研究建立的高效液相色譜法對進一步實現中生菌素母藥及相關制劑產品的質量控制具有一定的指導意義。