黑木耳多糖對高脂飲食大鼠腸道菌群的影響

白云飛，王雅楠，劉昕桐，霍寧寧，時若寒，李研東，譚力銘，李沖，楊新，韓雪，3*

（1.河北科技大學生物科學與工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北省獸藥監察所，河北 石家莊 050000；3.河北省功能食品技術創新中心，河北 石家莊 050000）

黑木耳（Auricularia auricula）作為一種藥食同源資源，具有豐富的營養和藥用價值[1]。黑木耳多糖（Auricularia auricula polysaccharides，AAP）是黑木耳中重要的活性成分[2]，作為天然活性多糖，已被證明具有廣泛的生理調節功能，目前研究熱點主要集中在黑木耳多糖的抗氧化[3]、抗腫瘤[4-6]、免疫調節[7]及益生作用[8]等方面。

針對黑木耳多糖益生作用的研究，通常以益生菌數量增殖效果為評價指標，而益生菌代謝產物或次級代謝產物對人體健康具有重要作用[9]。黑木耳多糖的腸道益生作用研究通常僅針對正常生理實驗動物的腸道菌群種類、數量等指標進行分析[10]，未充分考慮特殊生理人群和病理人群的特點。高血脂患者腸道菌群紊亂[11]，黑木耳多糖及其復配物是否具有針對該類人群的調節作用有待探究。本研究在提取并鑒定黑木耳多糖的基礎上，評價其對乳酸菌蛋白質類代謝產物的影響及其對高血脂人群的腸道益生作用，以期為未來高血脂人群功能性食品開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實驗動物

乳酸鏈球菌菌株（HW-1）：河北科技大學營養與功能性食品研究室保留菌種；黑木耳：中康蔬菜種植有限公司；銀耳多糖、山楂黃酮：河北科技大學營養與功能性食品研究室提供，乳酸菌培養用MRS液體或固體培養基[12]。辛伐他汀片：北京萬生藥業有限責任公司（批號：31801043）。

谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、超氧化物歧化酶測試盒、丙二醛測試盒、過氧化氫酶測試盒：南京建成生物科技有限公司。

DNA提取試劑盒：美國Omega生物技術公司；MiSeq測序試劑盒：美國Illumina公司；DNA凝膠回收試劑盒：美國Axygen公司；核酸純化試劑盒：美國Beckman Coulter公司；文庫定量試劑盒：美國KAPA公司。

SPF級雄性 Wistar大鼠，體質量（200±20）g，河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證SCXK（冀）2018-004。

高脂飼料配方：基礎飼料78.8%，豬油10%，蛋黃粉10%，膽固醇1%和膽酸鹽0.2%?；A飼料由河北醫科大學實驗動物中心提供?；A飼料配方見表1。

表1 基礎飼料配方Table 1 The formula of basic feed

1.2 儀器與設備

高通量測序儀（PE300）：美國Illumina公司；電泳儀（dyy-12）：北京市六一儀器廠；凝膠成像系統（Alpha Imager HP）：美國Protein Simple公司；生物分析儀（DE13806339）：安捷倫科技有限公司；生物大分子分析儀（LabChip GX）、實時定量 PCR 儀（ABI 7500）：美國Perkin Elmer公司。

1.3 方法

1.3.1 黑木耳多糖提取與鑒定

1.3.1.1 黑木耳多糖提取

將黑木耳用液氮冷凍法粉碎后過120目篩。采用水提醇沉法，在料液比 1∶60（g/mL）、溫度 60 ℃、超聲功率180 W的條件下提取20 min，于4 500 r/min離心6 min，收集上清液。重復提取3次，合并提取液干燥備用。用苯酚-硫酸法測定溶液中多糖含量[13]。

1.3.1.2 黑木耳多糖鑒定

參考莫開菊等[14]的方法，采用苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析黑木耳多糖的單糖組成。HPLC條件：SHISEIDO C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為0.1 mol/L KH2PO4（pH6.8）；流動相B為乙腈；A∶B=82∶18（體積比）；流速 1.0 mL/min；柱溫 25 ℃；進樣量10 μL；波長為245 nm。

1.3.2 黑木耳多糖對乳酸菌代謝產物影響

將對數生長期的乳酸鏈球菌按5%的接種量，接種到MRS液體培養基中，分別以0%、1%、5%、10%、20%、30%黑木耳多糖處理，37℃恒溫培養14 h。每2 h取樣并于4 200 r/min條件下離心20 min取上清液，采用考馬斯亮藍法[15]測定蛋白質含量。

1.3.3 黑木耳多糖體內益生作用分析

將36只SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為4組，分別為空白組（NC）、模型組（HFD）、辛伐他汀組（PCI）和復配物組（HDC），大鼠在自由采食高脂飼料的同時進行黑木耳多糖復配物干預，連續給藥5周，具體處理方式見表2。

表2 實驗設計方案（n=9）Table 2 Experimental design scheme（n=9）

1.3.4 檢測樣品采集

大鼠在末次灌胃12 h后，收集大鼠血清、肝臟和腦等器官，于-80℃保存備用。無菌收集結腸內糞便，置于無菌EP管中，迅速液氮冷卻后置于-80℃冰箱保存備用。

1.3.5 抗氧化能力分析

根據試劑盒說明指示，依次對腦、肝臟組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性進行測定。

1.3.6 Illumina高通量測序

對大鼠糞便樣品進行16S rRNA基因V3～V4區域的聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴展以及Illumina高通量測序?；谀c道菌群的16S rRNA基因V3～V4區域合成相關引物，進行PCR擴增，其中擴增所使用的引物序列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和 806R（5′-GGACTACNNGGG TATCTAAT-3′）[16]。擴增的體系和擴增條件見表3與表4。

表3 16S rRNA基因V3～V4區PCR擴增體系Table 3 16S rRNA gene V3-V4 region PCR amplification system

表4 PCR擴增條件Table 4 PCR amplification condition

1.3.7 數據統計分析

數據處理采用SPSS20.0進行統計學分析。用單因素方差分析法分析組間差異的顯著性，結果采用平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 黑木耳多糖提取結果

黑木耳多糖提取結果見圖1。

圖1 黑木耳多糖提取結果Fig.1 Extraction results of Auricularia auricula polysaccharides

通過掃描電鏡對黑木耳顆粒進行形態學觀察，如圖1（a）所示，冷凍粉碎處理的黑木耳樣品具有較高的粒度級別，并具有良好的粒度均一性。

采用苯酚硫酸法測定多糖，繪制標準曲線，如圖1（b）所示。獲得回歸方程為y=8.626 7x+0.140 3，相關系數R2=0.999 1。

本試驗通過冷凍粉碎方法對黑木耳進行前處理，多糖的提取率達10.2%。

2.2 黑木耳多糖鑒定

單糖組成色譜圖見圖2。

圖2 單糖組成色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of PMP derivatives

由圖2中各峰保留時間和峰面積，對黑木耳多糖的單糖組成進行分析，結果表明，黑木耳多糖中主要以葡萄糖、甘露糖為主，單糖比例葡萄糖∶甘露糖∶木糖∶巖藻糖∶半乳糖∶葡萄糖醛酸為 13.47∶8.64∶2.13∶1.95∶1.69∶1.00。

2.3 黑木耳多糖益生作用研究

黑木耳多糖對乳酸鏈球菌蛋白質代謝的影響結果如圖3所示。

圖3 黑木耳多糖對乳酸鏈球菌蛋白質代謝的影響Fig.3 Effects of different concentrations of polysaccharides on protein metabolism of lactic acid bacteria

當培養基中多糖含量為30%時，蛋白質含量隨時間呈拋物線式變化。在8 h時，培養基中的蛋白質含量達到最大值114.48 mg/L，隨后快速下降。多糖濃度0～20%時，乳酸菌的蛋白質代謝無顯著變化。

2.4 體內抗氧化能力分析

黑木耳多糖復配物對大鼠血清抗氧化能力的影響見表5。

表5 黑木耳多糖復配物對大鼠血清抗氧化能力的影響Table 5 Effects of A.auricula polysaccharides complex on serum antioxidant capacity in rats

黑木耳多糖復配物具有較好的抗氧化能力。由表5可知，與NC組相比，HFD組大鼠血清CAT活力與SOD 活力顯著降低（P＜0.05），GSH-Px活力降低、MDA含量升高，但不存在顯著差異（P＞0.05）。與HFD組相比，PCI組與HDC組的GSH-Px活力、SOD活力均有不同程度的升高，MDA含量降低。其中HDC組SOD活力顯著高于HFD組（P＜0.05）。

黑木耳多糖復配物對大鼠肝臟抗氧化能力的影響見表6。

表6 黑木耳多糖復配物對大鼠肝臟抗氧化能力的影響Table 6 Effects of A.auricula polysaccharides complex on antioxidant capacity of rat liver

由表6可知，與NC組相比，HFD組大鼠肝臟CAT活力和 GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA 含量顯著升高（P＜0.05）。與HFD組相比，HDC組GSH-Px活力顯著升高。

黑木耳多糖復配物對大鼠腦抗氧化能力的影響見表7。

表7 黑木耳多糖復配物對大鼠腦抗氧化能力的影響Table 7 Effects of A.auricula polysaccharides complex on antioxidant capacity of rat brain

由表7可知，與NC組相比，HFD組大鼠腦組織GSH-Px活力顯著降低（P＜0.05），MDA含量顯著升高（P＜0.05），SOD活力雖低于NC組，但沒有統計學差異（P＞0.05）。與HFD組相比，HDC組MDA含量顯著降低 P＜0.05）。

2.5 大鼠腸道菌群物種豐度及多樣性

2.5.1 分類單元聚類分析

分類單元（operational taxonomic units，OTU）交集維恩圖見圖4。

圖4 OTU交集維恩圖Fig.4 Venn diagram of OTU

試驗以OTU相似性為97%對11個樣本進行了OTU 分析，其中 NC 組（NC1～NC2），HFD 組（HFD1～HFD3）、PCI組（PCI1～PCI3）、HDC 組（HDC1～HDC3）。圖4可以看出，4組OTU 分別為 626、692、673、656個。共有的為527個。

2.5.2 Alpha多樣性分析

圖5為大鼠腸道菌群Alpha多樣性曲線。

圖5 大鼠腸道微生物的Alpha多樣性曲線Fig.5 Alpha diversity curve of intestinal microorganisms in rats

由圖5（a）可以看出，隨著抽樣數量的增加，測得的OTU數量先增大，后趨于平緩。說明已經獲得環境中絕大多數細菌序列，物種不會隨著測序數量的增加產生明顯的變化。從圖5（b）可知，曲線逐漸趨于平緩狀態，盡管增加抽樣數量可以提高OTU數量，但是不會改變物種多樣性。從圖5（c）可以看出，隨著樣本量的增大，OTU數量從快速增加到趨于穩定，此時腸道菌群數量不再增多，所以此時的數據量可以用于后續實驗。

圖6和表8為各個樣品Alpha多樣性分析。

表8 腸道微生物Alpha多樣性分析Table 8 Alpha diversity of gut micrabiota

圖6 Alpha多樣性指數Fig.6 Alpha diversity index

從圖6和表8可以看出，HFD組大鼠的腸道菌群chao1指數最大，即腸道菌群豐度最高，但不存在顯著性差異；HFD組大鼠腸道菌群Shannon指數顯著高于NC、HDC組（P＜0.05）；即HFD組大鼠腸道微生態多樣性明顯高于NC、HDC組，原因可能是高脂飲食改變了腸道生態，有害菌過度繁殖，使腸道菌群多樣性增加[17]。HDC組大鼠腸道菌群的豐富度以及多樣性更接近于NC組。

2.5.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性分析可以反映不同樣本之間的菌群組成差異。圖7為4組大鼠腸道菌群的組成，圖中的點表示個體菌群，點與點之間的距離反映菌群之間的序列相似度。

圖7 基于PLS-DA的4組大鼠腸道菌群組成分析Fig.7 Composition of intestinal flora of four groups of rats based on PLS-DA

從圖7中可以看出，HFD組大鼠的腸道菌群構成與NC組差別較大。PCI組與HDC組大鼠的腸道菌群構成與NC組相近，其中HDC組更接近正常大鼠。說明該復配物對腸道菌群具有正向調節作用。

2.6 大鼠腸道菌群結構分析

2.6.1 門水平差異分析

大鼠腸道菌群結構在門水平的差異見圖8。

圖8 大鼠腸道菌群結構在門水平的差異Fig.8 Microbial community structure at the phylum level

由圖8可知，在門水平上，大鼠腸道中最多的是厚壁菌門，其次是擬桿菌門。HDC組大鼠腸道內的放線菌門（16.41±1.81）%顯著高于 HFD 組（8.6±1.72）%（P<0.05）。HDC組擬桿菌門豐度較NC組和HFD組有下降的趨勢，但不存在顯著性差異。

2.6.2 屬水平差異分析

大鼠腸道菌群結構在屬水平的差異見圖9。

圖9 大鼠腸道菌群結構在屬水平的差異Fig.9 Microbial community structure at the genus lev

由圖9可知，在屬水平上，NC組大鼠腸道中菌屬相對豐度由高到低為 Lactobacillus、Romboutsi、Rumino-coccaceae UCG-014、Ruminococcus1、Ruminococcaceae NK4A214_group等。HFD 組（10.7±4.23）%、PCI組（4.40±1.11）%的乳酸菌相對豐度較 NC組（37.71±0.63）%均極顯著降低（P<0.01）；與HFD相比，HDC組Alistipes、螺桿菌、脫硫弧菌屬含量分別降低0.10%、0.34%、0.50%，Dorea、志賀氏菌含量均降低0.11%；雙歧桿菌、乳酸菌、乳球菌含量分別增加3.06%、9.12%、0.04%。

3 討論與結論

本實驗提取黑木耳多糖的單糖組成與莊偉等[7]的研究結果基本相符。結合已有的研究，黑木耳多糖的單糖組成與黑木耳來源相關，不同品種的黑木耳的單糖組成不同[18]。黑木耳多糖作為益生元，可有效促進乳酸菌的增殖[19]。薛依婷等[20]研究發現黑木耳多糖促進了酸乳中保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌的繁殖，并提高了酸乳中游離脂肪酸和胞外多糖的含量。Zhang等[21]研究發現黑木耳多糖的干預逆轉了高脂血癥大鼠中乳酸桿菌和Oscillibacter豐度下降的趨勢。本實驗將不同濃度的黑木耳多糖與乳酸菌共培養，培養過程中發現，當乳酸菌與30%黑木耳多糖共培養至8 h時，采用考馬斯亮藍法測定溶液中蛋白質濃度（114.48 mg/L）與空白組相比明顯提高。考馬斯亮藍法（Bradford法）測定溶液中的蛋白質含量，其工作原理為染料考馬斯亮藍G-250與蛋白質中的堿性氨基酸或芳香族氨基酸結合，在595 nm波長下有最大光吸收[22]。因此推測，隨著培養時間的延長，黑木耳多糖提高乳酸菌蛋白酶類的代謝水平，促進溶液中蛋白質的降解，使得特征氨基酸充分暴露出來并與染料結合，進而提高了其吸光度。

高脂飲食可以調節大鼠腸道菌群結構，從而對機體的健康產生影響。本研究中發現，高脂飲食大鼠腸道菌群與空白組相比產生了明顯的差異，腸道中的有害菌增加，如志賀氏菌、螺桿菌、β-變形菌綱、伯克霍爾德氏菌目、梭菌屬、糞球菌屬等；有益菌的相對豐度降低，如乳酸桿菌、雙歧桿菌等。將黑木耳多糖與銀耳多糖和山楂黃酮復配后，對高脂飲食大鼠進行干預，觀察到大鼠的腸道菌群結構發生變化，其結構向正常大鼠的腸道菌群結構轉變，有害菌減少，乳酸菌等有益菌的增多。這與Zhang等[21]的研究結果一致。其原因可能是黑木耳多糖影響了乳酸菌的蛋白質水解系統，增強了胞外蛋白酶活性，促進了蛋白質水解為多肽。多肽通過乳酸菌的多肽轉運系統進入細胞，促進了乳酸菌的代謝水平。乳酸菌進一步抑制腸道有害菌，改善腸道菌群結構，并調節宿主代謝[23-25]。另一方面，在蛋白質水解過程中還可以產生其它分子，如與乳酸菌益生作用相關的生物活性肽[26]。

綜上所述，黑木耳多糖對乳酸菌的代謝產物具有一定的調節作用，并且黑木耳多糖復配物對高脂飲食造成的腸道菌群紊亂具有調節恢復作用，同時可以在一定程度上增強機體的抗氧化能力。