LC-MS/MS法和HPLC法檢測人血清中利培酮和九羥利培酮血藥濃度的對比研究*

鄧順順，梁國朝，高永雙

廣東省中山市第三人民醫院檢驗科，廣東中山 528400

血藥濃度受患者基因多態性、并發疾病、肝腎功能改變、藥物劑型、藥物相互作用及高蛋白飲食等眾多因素的影響，從而使得常規用藥可能導致不同患者出現不同的臨床療效[1]。治療藥物監測是針對不同患者個體，針對性制訂給藥方案的一種有效方法[2]。非典型抗精神病藥物利培酮是目前臨床廣泛使用的一線治療藥物，化學結構屬于苯并異噁唑類衍生物，是5-羥色胺的選擇性拮抗劑和多巴胺D2受體[3-5]。對于首發精神分裂癥患者仍多選擇藥物治療，其中氯氮平、利培酮、阿立哌唑均是比較常見的藥物[6]。精神分裂癥的患者需要長期使用藥物維持治療，以減輕精神癥狀，控制疾病發作[7]。抗精神病藥物引起的血糖、血脂代謝紊亂，是心腦血管疾病、糖尿病等多種疾病潛在的生物學危險因素[8]。利培酮在肝臟經9-羥基化、N-去甲基化等途徑代謝，主要代謝產物為九羥利培酮，與利培酮具有相同的活性[9]。九羥利培酮血漿消除半衰期較長，對服用利培酮的患者進行治療藥物監測時，需要同時檢測利培酮和九羥利培酮。因此，同時檢測利培酮與九羥利培酮能準確反映療效和不良反應發生率[10]。

本研究對本實驗室同時開展的液質聯用質譜(LC-MS/MS)法和高效液相色譜(HPLC)法檢測利培酮和九羥利培酮血藥濃度進行性能驗證，在驗證合格的基礎上進一步對比LC-MS/MS和HPLC兩種方法的檢測結果，以觀察結果的差異性，確定實驗室檢測方案。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 島津LCMS-8040三重四級桿液質聯用質譜儀，Agilent-1200高效液相色譜分析儀，Eppendorf-5424R臺式低溫高速離心機，Eppendorf移液槍，上海安亭低速離心機，上海醫大渦旋混合器，帕恩特-XYB-H普通分析級純水機，昆山KQ-300DV超聲波清洗器，德國塞多利斯BT25S十萬分之一分析天平，常熟百靈LP1002型1/100電子天平，中科美菱DW-HL218超低溫冰箱。LC-MS/MS法檢測試劑：水相、有機相、內標母液、稀釋劑1、標準曲線試劑均購自深圳品生公司。HPLC法檢測試劑：利培酮購自西安楊森制藥有限公司，9-羥利培酮、曲唑酮購自美國SIGMA公司，甲醇、乙腈(色譜純)購自德國默克公司，水為去離子水。

1.2方法

1.2.1血液標本處理 靜脈血5 mL室溫凝固后以4 000 r/min離心5 min，分離出的上清液為血清標本，進行第一次檢測之后，將剩余的血清標本吸取約1.5 mL保存到小型離心管中，-20 ℃冰箱保存。將凍存于-20 ℃冰箱的標本拿出，放置于室溫，復融后開始檢測，每個標本只復融一次，避免反復凍融可能影響檢測結果。

1.2.2色譜與質譜條件 LC-MS/MS法：預柱(Phenomenex，Security Guard Ultra Cartridges，AJ0-8775)，色譜柱(Phenomenex，Kinetex XB-C18，2.6 μm，3 mm×50 mm)；二元高壓梯度洗脫，流速為0.4 mL/min；柱溫45 ℃；進樣量5 μL，采用電噴霧電離化(ESI)，正離子模式，加熱模塊溫度為450 ℃，脫溶劑管溫度200 ℃，噴氣壓力為230 kPa，流速20.0 L/min；采用多反應監測模式掃描。HPLC法：色譜柱為Eclipse Plus C18柱(150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國Agilent)，流動相(甲醇∶乙腈∶水為1.5∶1.7∶6.2)；每100 mL流動相中加入0.85 mL正丁胺，0.85 mL冰乙酸；流速為1.0 mL/min。

1.2.3穩定性試驗 用質控血清標本(低、中、高3個濃度)各3份，檢測其在-20 ℃ 保存1、14、31 d的穩定性。

1.2.4批內精密度 在同一天內，使用低、中、高3個濃度的標本分別進行5次獨立測試。

1.2.5批間精密度 使用低、中、高3個濃度標本，每天分別進行5次獨立測試，檢測3 d，共獲得45個測試數據。

1.2.6線性范圍驗證試驗 配制8個已知濃度的標準品，在1個分析批內，對每個濃度點重復檢測2次，進行線性回歸分析，評價峰面積比值與濃度之間的線性關系，并計算檢測濃度與已知濃度的偏差。

1.2.7提取回收率試驗 在空白血清標本中加入不同體積標準溶液(標準溶液體積應少于總體積的10%)，制備3個濃度的標本(標本終濃度在測量區間內)。每個標本重復檢測3次計算均值濃度、回收率。

1.2.8比對試驗 用LC-MS/MS法和HPLC法檢測同一例患者血清標本，并對檢測結果進行比較分析。分段收取本院住院患者常規檢測利培酮和九羥利培酮血藥濃度標本共60份。每份標本當天檢測一次并發放報告，將剩余血清吸出，置于1.5 mL小型離心管中，保存在-20 ℃冰箱中，30 d內用另一種方法檢測，對兩種方法檢測出的相同標本的結果進行比較分析。

2 結 果

2.1性能試驗驗證結果 質控品在-20 ℃保存1、14、31 d的條件下，相對標準偏差均<15%，結果穩定。

LC-MS/MS法：利培酮低、中、高濃度(20、100、160 ng/mL)血清標本的提取回收率分別為105.72%、102.06%，101.27%；九羥利培酮低、中、高濃度(100、500、800 ng/mL)血清標本的提取回收率分別為92.06%、95.17%，102.29%。利培酮的線性范圍為1.07～203.23 ng/mL，九羥利培酮的線性范圍為5.60～1 033.34 ng/mL，最大允許偏差均<15%，r2均≥0.99。

HPLC法：利培酮低、中、高濃度(4、16、48 ng/mL)血清標本的提取回收率分別為110.0%、91.9%，107.5%；九羥利培酮低、中、高濃度(10、40、120 ng/mL)血清標本的提取回收率分別為90.0%、104.0%，110.3%。利培酮的線性范圍為2.52～57.65 ng/mL，九羥利培酮的線性范圍為5.39～141.23 ng/mL，r2均≥0.99。

兩種方法的批內、批間變異系數均<15%，精密度良好。性能驗證試驗均通過。

2.2利培酮/九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法檢測結果比較 Shapiro-Wilk法顯示LC-MS/MS法與HPLC法檢測結果均呈正態分布。Pearson相關分析結果顯示利培酮HPLC法與LC-MS/MS法結果呈正相關(r=0.984，P<0.05)，九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法結果也呈正相關(r=0.949，P<0.05)。檢測結果比較見表1。以LC-MS/MS法檢測結果為橫坐標，HPLC法檢測結果為縱坐標分別繪制的散點圖見圖1。

表1 利培酮/九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法檢測結果比較

注：A為檢測利培酮結果的散點圖；B為檢測九羥利培酮結果的散點圖。

2.3利培酮/九羥利培酮HPLC法與LC-MS/MS法檢測結果的偏差圖 根據Bland-Altman偏差圖可以得知，LC-MS/MS法檢測利培酮與九羥利培酮的結果分別比HPLC法檢測結果高1.97 ng/mL和1.38 ng/mL，95%置信區間分別為-5.81～9.74、-10.28～11.66，見圖2、3。

圖2 LC-MS/MS法和HPLC法檢測患者九羥利培酮濃度結果的Bland-Altman偏差圖

圖3 LC-MS/MS法和HPLC法檢測患者利培酮濃度結果的Bland-Altman偏差圖

3 討 論

本研究LC-MS/MS法采用的是品生公司提供的操作方法和試劑，HPLC法采用的是自配試劑，兩種方法檢測利培酮與九羥利培酮均采用同位素內標法，通過測量內標物及被測組分的峰面積相對值來進行結果計算，經驗證兩種方法均能很好地應用于利培酮和九羥利培酮血藥濃度的檢測中。HPLC由儲液罐、高壓輸液泵、進樣裝置、色譜柱、檢測器、記錄儀和數據處理系統組成[12]。LC-MS/MS法是將HPLC與質譜分別作為分離系統和檢測系統，待測試樣在HPLC部分經過分離后，進入質譜部分，標本與流動相分離后，經離子源對標本進行離子化，按離子的質荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度，從而實現分析目的的一種分析方法[13]。所以LC-MS/MS法是集HPLC法的高分離效能與質譜的高鑒定性能于一體，靈敏度較傳統的HPLC法高3～4個數量級，對研究對象有足夠的靈敏度、選擇性，能分析更多的物質，分析能力更好。

近幾年，LC-MS/MS法不斷發展，由于其具有高效的色譜分離和專屬特異的質譜檢測等優勢而被廣泛應用于生物標本的分析[14]。隨著色譜分析技術越來越多地運用于臨床檢測當中，實驗室類似設備越來越多，根據需求會開展不同或者同一項目，比對分析已經成為日常檢測質量控制中的重要一環。依據《全國臨床檢驗操作規程》要求實驗室內采用不同方法或儀器檢驗的同一項目，應進行一致性比較，定期實施比對(至少每年一次)及時解決比對試驗中出現的問題，并保留記錄[15]。LC-MS/MS檢測設備靈敏度和特異度均高于HPLC檢測設備，運用前景良好，但設備價格昂貴，對于檢測量不高的項目很多還是需要用到價格相對便宜的HPLC設備進行檢測。實驗室制訂好規章制度，按要求做好比對試驗，做好詳細記錄，在性能驗證和比對驗證合格之后，若一臺設備出現故障維修或需要維修保養期間，可以及時啟用另一臺設備開展相關檢測，充分提高設備檢測利用率，提高檢測時效。兩種方法均可用于日常檢測，但兩者檢測結果存在差異，如果是需要長期監測的患者建議一直選用同一種方法檢測。