GeneXpert MTB/RIF系統對結核病診斷價值的回顧性分析

陳 晶，丘 文，蘇 冰，胡秀梅，林 麗，周 芳，肇恒瑞，芮勇宇

南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣東廣州 510515

結核病是由結核分枝桿菌復合菌群引起的一種慢性傳染病，是我國的乙類傳染病，以炎性滲出、增生和干酪樣壞死為主要病理變化。世界衛生組織發布的《全球結核病報告》指出結核病是世界上最重要的傳染性疾病之一，被認為是全球十大死亡原因之一[1]。早期發現結核病是成功治療和減少疾病傳播的關鍵。全球結核分枝桿菌潛伏感染的人數約17億，占世界人口總數的1/4左右，每年新發結核病患者均在1 000萬例左右。而我國的結核病新發病例數位列第二(9%)，僅次于印度(27%)，此外，肺外結核的發病率也呈現逐年上升的趨勢[2]。

結核病的治療以化療為主要手段，如今耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐多藥結核病(XDR-TB)對結核病的防控帶來了嚴峻的挑戰。因此，早期診斷和治療結核病，以及采取有效的公共衛生措施，對結核病患者預后至關重要。結核病發病率居高不下，這很大程度上是因為結核病的診斷方法的局限性[3]。結核病的診斷主要通過詢問病史和癥狀體征，影像學、免疫學和病原學檢查等多種方法綜合運用。結核病常用的實驗室檢查方法有抗酸染色鏡檢、結核菌素試驗、羅氏培養法、γ-干擾素釋放(IGRA)試驗、血清結核分枝桿菌免疫球蛋白(Ig)G抗體檢測、結核分枝桿菌基因(TB-DNA)擴增檢測，以及近年來受到廣泛應用的GeneXpert MTB/RIF結核分枝桿菌鑒定。本文將GeneXpert MTB/RIF結核分枝桿菌鑒定技術與幾種常用的檢測方法進行比較，回顧性分析和評價幾種檢測方法的效能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取南方醫科大學南方醫院2020年1-5月進行GeneXpert MTB/RIF結核分枝桿菌鑒定的住院患者669例為研究對象，其中男430例，女239例；年齡2～92歲；檢測住院患者標本中自然咳痰363例，肺泡灌洗液266例，胸腔積液21例，腦脊液6例，穿刺液4例，抽吸痰3例，引流液2例，糞便2例，腹水1例，中段尿1例。經鑒定有113例住院患者(男73例，女40例)診斷為結核病患者，556例(男357例，女199例)診斷為非結核病患者，納入和排除標準均根據《肺結核診斷：WS288-201》相關標準執行[4]。669例住院患者中39例進行了結核菌素試驗，66例進行了結核分枝桿菌IgG抗體檢測，189例進行了羅氏培養法檢測，286例進行了TB-DNA擴增檢測，35例進行了IGRA試驗，667例進行了涂片抗酸染色鏡檢。

1.2儀器與試劑 GeneXpert分子診斷系統購自美國賽沛公司；IGRA檢測試劑盒購自德國Qiagen公司；冷染法抗酸染色液試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；結核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒購自新加坡MP生物醫學亞太公司；結核分枝桿菌復合群核酸檢測試劑盒購自德國Qiagen公司(PCR-熒光探針法)；結核分枝桿菌純蛋白衍生物試劑、酶標儀購自北京祥瑞生物制品有限公司。

1.3方法

1.3.1GeneXpert MTB/RIF試驗 吸取2 mL標本處理液于前處理管中，加入1 mL標本(標本應不含食物顆粒和血液)，旋緊蓋子后置于振蕩器上充分混勻10～20 s，直至標本充分液化，無肉眼可見的固體物質存在。將2 mL處理后的標本緩慢加入Cartridge反應盒內(防止氣泡產生)。將Cartridge反應盒放于GeneXpert儀器中進行檢測，儀器將自動完成核酸提取、純化、擴增等過程，待反應完成后，系統自動判讀結果。

1.3.2結核菌素試驗 75%乙醇消毒注射部位，用1 mL注射器抽取0.1 mL 結核菌素(5 IU)，注射于前臂掌側中下端1/3交界處，避開疤痕、血管和褶皺，注射處呈直徑約為6～10 mm的白色隆起，72 h后觀察結果。結果判斷標準：無反應或僅有輕微紅暈，硬結直徑<5 mm者為陰性；硬結直徑≥5 mm或有水皰、壞死、潰瘍、雙圈、淋巴管炎等均判斷為陽性。

1.3.3結核分枝桿菌IgG抗體檢測(膠體金法) 將25 μL血清標本加入加樣孔，當標本遷移至藍色指示線時，加入3滴緩沖液至橢圓孔。拉出分離片，再加入1滴緩沖液于加樣孔，15 min后判讀結果。判讀結果時，確保質控線處有紫色條帶，如果在測試線處有紫色條帶則判讀為陽性，若僅有質控線處有紫色條帶，則判讀為陰性。

1.3.4抗酸染色鏡檢 將標本充分混勻后，取適量標本于玻片正面均勻涂抹成10 mm×20 mm左右的形狀。自然干燥后，用酒精燈火焰固定后進行萋-尼氏染色。在高倍鏡下，連續觀察300個不同視野，采用世界衛生組織的6層報告方式判讀結果。

1.3.5羅氏培養法 將痰液等標本做去污染處理后，取標本0.1～0.3 mL，接種于羅氏固體斜面培養基上。體液類標本離心后直接接種于羅氏培養基上。將接種好的羅氏培養基置于37 ℃、5%CO2的溫箱中培養。

1.3.6IGRA試驗 將肝素鋰抗凝全血1 mL分別加至測試管、陽性對照管、陰性對照管中，于37 ℃孵育24 h。離心后取上清液，通過酶聯免疫吸附試驗檢測γ-干擾素，450 nm波長的條件下讀取各孔吸光度值，按試劑盒說明書要求對結果進行判讀。

1.3.7TB-DNA擴增檢測 標本中加入適量NaOH溶液，搖勻后置室溫下液化至無固態物質，取1.0 mL于小型離心管中，12 000 r/min離心5 min，留沉淀加1 mL生理鹽水混勻。相同條件離心5 min。1 mL水洗滌沉淀，再次離心。留沉淀加50 μL樣品提取液充分混勻。100 ℃水浴15 min后，離心5 min。上清液作為PCR反應模板。PCR反應后取樣品管于熒光儀中分析，記錄數據。

1.4統計學處理 采用SPSS23.0統計軟件對數據進行處理和分析，計數資料以例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用診斷性試驗比較GeneXpert MTB/RIF試驗、IGRA試驗和TB-DNA擴增檢測這3種檢測方法對結核分枝桿菌感染的診斷價值；繪制受試者工作特征(ROC)曲線評估其診斷效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各種結核分枝桿菌檢測方法的診斷評價 以臨床最終診斷為金標準，7種檢測方法的靈敏度排前三位的是IGRA試驗(83.33%)、GeneXpert MTB/RIF試驗(53.98%)和結核菌素試驗(38.89%)；與GeneXpert MTB/RIF試驗靈敏度比較，IGRA試驗、結核菌素試驗靈敏度差異均無統計學意義(χ2=1.987、1.417，P>0.05)，結核分枝桿菌IgG抗體檢測、TB-DNA擴增檢測、抗酸染色鏡檢靈敏度均較低(χ2=8.754、11.625、54.849，P<0.05)。

7種檢測方法的特異度從高到低依次是羅氏培養法/TB-DNA擴增檢測、GeneXpert MTB/RIF試驗/抗酸染色鏡檢、結核分枝桿菌IgG抗體檢測、結核菌素試驗、IGRA試驗。與GeneXpert MTB/RIF試驗特異度比較，羅氏培養法、TB-DNA擴增檢測、抗酸染色鏡檢特異度差異均無統計學意義(χ2=0.541、0.837、0.000，P>0.05)，IGRA試驗、結核菌素試驗、結核分枝桿菌IgG抗體檢測特異度均較低(χ2=237.881、143.289、89.313，P<0.05)。GeneXpert MTB/RIF試驗具有較高的準確度，而結核菌素試驗的準確度最低。見表1、2。

表1 各種結核分枝桿菌檢測方法的結果(n)

2.2GeneXpert MTB/RIF試驗、IGRA試驗和TB-DNA擴增檢測結核分枝桿菌的ROC曲線分析 GeneXpert MTB/RIF試驗、IGRA試驗和TB-DNA擴增檢測的曲線下面積(AUC)分別為0.769、0.738、0.636，見圖1。

表2 各種結核分枝桿菌檢測方法對結核感染的診斷價值評價

圖1 3種檢測方法的ROC曲線

3 討 論

結核菌素試驗、結核分枝桿菌IgG抗體檢測與IGRA試驗這3種檢測方法，都是以機體的免疫反應來檢測是否感染了結核分枝桿菌。本研究中IGRA試驗的陰性預測值和靈敏度分別為93.75%和83.33%，是3種方法中檢測效果最佳的，這與相關研究一致[5]。然而，這3種檢測方法的陽性結果并不能確診活動性結核病，只能反映感染過結核分枝桿菌。此外，接種卡介苗也會使結核菌素試驗和結核分枝桿菌IgG抗體檢測呈現陽性結果，陰性也不能排除未感染結核分枝桿菌，仍有較多情況導致假陰性結果的出現，如感染初期機體還未產生免疫應答或免疫缺陷，可能會使患者細胞免疫功能降低。而IGRA試驗使用的是結核分枝桿菌的特異性抗原ESAT-6和CFP-10來刺激體內激活的特異性T淋巴細胞，這在很大程度上保證了結果的特異度，且接種卡介苗不會引起假陽性反應[6]。雖然IGRA試驗的靈敏度和陰性預測值均較高，但依然有一定的漏診率。研究發現，高齡和外周血淋巴細胞數目過低是導致IGRA試驗假陰性的重要因素[7]。甚至有部分IGRA試驗陰性結果是由于這類人群對結核分枝桿菌未產生任何適應性免疫反應，或是產生獨立于干擾素的免疫反應[8]。另外，IGRA試驗不能區分活動性結核病和結核分枝桿菌潛伏感染，但在這3種檢測方法中，推薦IGRA試驗為首選的結核病檢測方法，IGRA試驗陰性預測值可以用來對結核病進行排除性診斷，當檢測結果為陽性時，還需結合其他輔助檢查和臨床表現來綜合判斷。

GeneXpert MTB/RIF試驗、羅氏培養法、TB-DNA擴增檢測和抗酸染色鏡檢同屬于病原學檢測手段，其檢測特異度均較高[9]。抗酸染色鏡檢方便快捷，該方法的陽性結果對結核病的診斷有極大的參考價值，但其靈敏度低，每毫升標本中至少含5 000～10 000個細菌時才能呈現抗酸染色鏡檢陽性結果。本研究669例患者中，有667例同時進行了抗酸染色鏡檢和GeneXpert MTB/RIF試驗，兩種方法的檢測結果差異有統計學意義(P<0.05)，但抗酸染色鏡檢陽性不能確定標本中的細菌即為結核分枝桿菌。本研究中羅氏培養法靈敏度僅為2.56%，在189例同時進行了羅氏培養法檢測和GeneXpert MTB/RIF試驗的患者中，羅氏培養法檢測結果只有1例為陽性。另外，羅氏培養法雖然含有孔雀石綠等成分可抑制雜菌生長，但其污染率仍較高，導致培養結果受到干擾[10]。

GeneXpert MTB/RIF試驗和TB-DNA擴增檢測都是應用PCR原理的檢測手段。GeneXpert MTB/RIF試驗的靈敏度明顯高于TB-DNA擴增檢測[11]，且GeneXpert MTB/RIF試驗自動化程度高、檢測時間短、操作難度小、安全性高，能夠針對性地檢出是否含有利福平耐藥基因，是其他幾種方法所不具備的優勢。但GeneXpert MTB/RIF試驗僅對利福平耐藥基因rpoB是否突變進行檢測，針對常見的異煙肼耐藥基因inhA和katG，該方法并不能檢出，對MDR-TB和XDR-TB可能會漏診[12]，這很大程度上限制了該方法的應用。此外，GeneXpert MTB/RIF試驗的靈敏度還有待提高。研究發現，在肺外結核中，GeneXpert MTB/RIF試驗的靈敏度和特異度不夠理想[13]。尤其是在結核性腦膜炎中，GeneXpert MTB/RIF試驗的陰性結果并不能很好地排除結核，這可能與腦脊液標本中的含菌量較少有關[14]。本研究中未能收集到人類免疫缺陷病毒與結核分枝桿菌雙重感染的患者標本，人類免疫缺陷病毒與結核分枝桿菌雙重感染的患者由于自身免疫系統受損，往往結核的免疫學檢測會出現假陰性而導致漏診，但過去的研究表明GeneXpert MTB/RIF試驗在這類患者中也有良好的表現[15]。由于本院并非結核病定點醫院，結核病標本數量，尤其是耐藥性結核病標本數量較少，本研究未能對GeneXpert MTB/RIF試驗診斷耐藥性結核病的效能進行評價。但有研究表明該方法對利福平耐藥檢測的陽性預測值不高[13]，因此是否需要對該方法檢測的利福平耐藥結果進行傳統方法的驗證，還需進一步研究。

綜上所述，在免疫學檢測方法中，因IGRA試驗的靈敏度和陰性預測值均較高，推薦使用其進行結核病的初篩，通過IGRA試驗進行疑似結核病的排除能起到較好的效果。而在病原學檢測方法中，GeneXpert MTB/RIF試驗具有良好的特異度和準確度，推薦使用其作為結核病的確診手段[16]。為提高檢測方法的靈敏度，良好的標本采集、運輸和保存等環節對結果起著至關重要的作用。如留取痰液標本時，受檢者應清晨以清水漱口后，用力咳出的深部痰(膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質的痰液)為較合格的標本，以3～5 mL為宜。肺外結核病應留取病變部位的穿刺液、引流液等。另外，影像學方法對結核病的診斷也十分重要。影像學、實驗室檢驗方法和臨床表現在結核病的診斷上均有著關鍵作用，需要綜合分析才能對結核病進行早診斷、早治療。