CALML3鑒別診斷肺腺癌和鱗狀細胞癌的潛在價值分析

蘇培淵，楊 清，付 兵，陳岳威，黃文輝

成都中醫藥大學附屬醫院胸心外科，四川成都 610075

肺癌是全球范圍內對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其死亡率位居惡性腫瘤的首位[1-2]。肺癌患者中約有85%的患者為非小細胞肺癌，其中約50%的非小細胞肺癌患者組織病理學分類屬于肺腺癌(LUAD)，約30%的患者組織病理學分類屬于肺鱗狀細胞癌(LUSC)。LUAD和LUSC在轉錄組水平、細胞網絡調控、預后特征及治療反應中的表現明顯不同[3-4]。因此，準確區分這2種亞型對于肺癌的診斷和治療尤為重要。

近年來，隨著醫學技術的不斷發展和提高，肺癌的治療模式已從依據分期制訂治療方案的模式轉變為依據基因組學、組織學分類制訂精準治療方案的先進治療模式。因此，如何精準鑒別LUAD和LUSC，對肺癌的靶向治療起到關鍵作用。目前，LUAD和LUSC實驗室的鑒別診斷常見標志物主要為甲狀腺轉錄因子-1(TTF-1)、新天門冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、腫瘤蛋白p63(TP63)、細胞角蛋白(CK)5/6/7，其對肺癌鑒別診斷的準確率可達到75%以上[3,5]。然而，現有的實驗室標志物對肺癌鑒別診斷準確率仍然無法讓臨床滿意，需要發現新的、更高診斷準確率的標志物用于肺癌的鑒別診斷。

鈣調蛋白樣蛋白3(CALML3)是一種鈣敏感蛋白，其對細胞黏附和運動起重要調控作用。研究發現CALML3在乳腺癌、胃癌、肝癌中作為抑癌基因，在腫瘤組織中表達明顯降低[6]。CHEN等[6]通過免疫組化檢測發現，CALML3在LUAD和LUSC中表達升高，且能夠作為有效鑒別區分LUAD和LUSC的免疫組化標志物。但CALML3 mRNA在肺癌組織的表達情況，以及能否作為一個定量生物標志物有效區分LUAD和LUSC還有待研究。

本研究系統地對癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中CALML3測序數據進行綜合分析，探討CALML3 mRNA在LUAD和LUSC中的表達水平、預后價值，以明確CALML3作為區分LUAD和LUSC的候選標志物的可能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年3—12月在本院胸心外科接受根治性手術的肺癌患者，年齡42～72歲，中位年齡56歲，收集患者相關資料如性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分期、腫瘤亞型及淋巴結轉移程度等。手術留取其癌組織及其癌旁正常組織標本(距離腫瘤邊緣5 cm以上)。納入標準：標本收集前患者均未接受過手術治療、化療或放療，且均通過病理學檢查確診為肺癌。排除標準：多發腫瘤，腫瘤原發病灶不能明確，其他器官腫瘤轉移至肺部者。最終選取50例LUAD患者和50例LUSC患者納入研究。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準，且所有參與本研究患者均已簽署知情同意書。

1.2UALCAN和GEPIA數據庫差異表達基因分析 采用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫分析TCGA數據庫中LUAD和LUSC實體瘤和相對于癌旁正常組織中差異基因的表達情況，以改變倍數|log2FC|≥1，P<0.05為標準。

1.3組織RNA的提取與實時熒光定量PCR(qPCR)擴增 采用Trizol提取試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)提取組織RNA，PrimeScriptTMRTⅡ反轉錄試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)將RNA反轉錄為cDNA。通過Primer-blast對CALML3和GADPH進行在線引物設計。CALML3正向：5′-TGGATGAGCAGGGGATGAGA-3′，反向：5′-GCTGCCAGCGTATCCATTTG-3′；GADPH正向：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反向：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。采用SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司)進行PCR擴增，反應總體積20 μL，反應條件：預變性95 ℃ 30 s后，進行40個循環反應(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)。應用ABI 7500 Fast Real-time PCR擴增儀檢測每個擴增循環后SYBR?Green熒光信號水平，運用溶解曲線檢測擴增產物純度。采用相對定量2-ΔΔCt的方法計算CALML3 mRNA的相對表達水平。

2 結 果

2.1CALML3在LUAD和LUSC中的表達情況 通過使用UALCAN數據庫對TCGA數據進行統計分析，發現CALML3在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多種類型的實體瘤中表達降低，而在LUAD、LUSC及宮頸鱗狀細胞癌等腫瘤中表達升高。CALML3在LUSC組織中相對表達水平為436.059(105.149，904.051)，明顯高于癌旁正常組織[0.447(0.143，0.810)]，約為癌旁正常組織的975倍(P<0.05)，見圖1A。CALML3在LUAD組織中相對表達水平為0.061(0.000，0.175)，是癌旁正常組織[0.032(0.000，0.093)]的1.9倍(P=0.003)，見圖1B。與相對應癌旁正常組織相比，CALML3在LUSC中的改變倍數是在LUAD中的7 149倍。由于設定小于改變倍數閾值(|log2FC|≥1)，即改變倍數≥2具有差異，而CALML3在LUAD組織中的相對表達水平僅為癌旁正常組織的1.9倍，因此CALML3在LUAD組織中的相對表達水平相對于癌旁正常組織沒有明顯的改變。

注：A為CALML3在LUSC中的表達情況；B為CALML3在LUAD中的表達情況。

為了進一步確認CALML3在LUAD和LUSC中的表達情況，采用GEPIA對TCGA數據進行提取分析，發現與癌旁正常組織相比，CALML3在LUSC組織中表達明顯升高，而在LUAD組織中表達無明顯差異，與UALCAN分析結果一致，見圖2。

圖2 CALML3在LUAD和LUSC中的表達情況

2.2CALML3與LUSC、LUAD的臨床特征分析 LUSC患者性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分期及淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平沒有影響(P>0.05)。CALML3在61～80歲的LUAD患者中相對表達水平[0.061(0.000，0.175)]高于21～40歲的LUAD患者[0.041(0.036，0.046)]，差異有統計學意義(P=0.003)。此外，LUAD患者的淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平有影響(P<0.05)，然而腫瘤分期、性別和吸煙情況對CALML3的相對表達水平沒有影響(P>0.05)。

2.3CALML3與LUSC、LUAD患者生存情況的相關性分析 CALML3與LUSC、LUAD患者總體生存期(OS)和無病生存期(DFS)不具有相關性(P>0.05)。

2.4CALML3對LUSC和LUAD的鑒別作用 CALML3在LUSC組織中的相對表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A。CALML3在LUAD組織中的相對表達水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3B。CALML3在LUAD組織中的相對表達水平明顯低于LUSC組織(LUSC/LUAD=3.653)。

注：A為CALML3在LUSC組織中的表達情況；B為CALML3在LUAD組織中的表達情況。

2.5CALML3對LUSC和LUAD的診斷價值 以LUAD為對照，CALML3診斷LUSC的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)為0.837，95%CI：0.753～0.922，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。當最佳臨界值為2.155時，其靈敏度為0.720(95%CI：0.575～0.838)，特異度為0.860(95%CI：0.733～0.942)。見圖4。

圖4 CALML3鑒別診斷LUSC和LUAD的ROC曲線

3 討 論

肺癌的主要病理類型為LUAD和LUSC，然而它們的分子生物學特征、治療方法和治療結果存在很大差異，因為其靶向治療取決于組織學的精準分型，因此準確判斷非小細胞肺癌患者的分型，對患者靶向治療方案的確定至關重要[7]。

有研究發現，橋粒芯蛋白3和橋粒膠連蛋白3為潛在的LUSC生物標志物[7]。雖然其在鑒別診斷非小細胞肺癌上具有一定的優勢，但仍有許多確診的肺癌病例對LUAD和LUSC標志物呈雙陽性現象[7]。因此，尋找更為準確且能夠完全有效區分LUAD和LUSC的分子診斷標志物，對于LUAD和LUSC的鑒別和治療尤為重要。

CALML3是一種鈣依賴性細胞黏附分子跨膜糖蛋白編碼基因，其作為肌球蛋白10的調節劑，能夠與肌球蛋白10競爭性結合，對細胞黏附和運動起重要調控作用。CALML3已被證實可作為乳腺癌、胃癌、肝細胞癌的新型生物標志物和治療靶點[6,8]。然而，CALML3在肺癌中的表達情況知之甚少。為了明確CALML3在腫瘤中的表達情況，本研究通過UALCAN 和GEPIA兩大數據庫對TCGA數據提取分析，發現CALML3在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤中表達降低，而在LUSC及宮頸鱗狀細胞癌等腫瘤中表達升高，這說明CALML3在肺癌發生發展進程中起著癌基因的作用。

CALML3與腫瘤的侵襲轉移相關[8]。CALML3作為肝癌的抑制劑可在體外和體內抑制肝癌的癌變和轉移進程的激活，同時高表達的CALML3對肝癌生長和肺轉移有明顯的抑制作用[8]。本研究對CALML3在LUSC和LUAD中的表達水平與臨床特征進行分析，發現LUSC患者的性別、年齡、吸煙情況、腫瘤分期及淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平沒有影響，而LUAD患者的年齡、淋巴結轉移程度對CALML3的相對表達水平有影響。但其具體機制尚不清楚，后續將深入探究。

CALML3除了參與腫瘤侵襲轉移進程外，還與腫瘤預后明顯相關。LIANG等[9]發現低表達的CALML3與CALML3甲基化及胃癌患者OS呈正相關。LI等[10]對基于TCGA的RNA測序和甲基化數據進行綜合分析并建立肝癌預后風險模型，同樣發現CALML3甲基化程度和表達水平與肝癌患者預后具有相關性。為了明確CALML3表達水平是否與肺癌患者預后具有相關性，本研究采用GEPIA數據庫分析發現CALML3與LUSC、LUAD患者的OS和DFS不具有相關性。

CALML3在LUSC和LUAD中的鑒別作用報道極少，且其在肺癌中的表達和功能更鮮為人知。ZHAN等[3]通過對TCGA數據庫中的RNA測序數據進行分析發現，CALML3在LUSC中表達水平改變倍數相當于LUAD的71.17倍，且CALML3鑒別LUSC和LUAD的AUC為0.964。隨后ZHAN等[3]進一步通過免疫組化染色對CALML3進行分析發現，CALML3在LUSC和LUAD中的表達分布明顯不同，CALML3鑒別LUSC、LUAD的靈敏度和特異度分別為90%和98%。為了進一步驗證CALML3在LUSC和LUAD中的表達情況，以及CALML3對LUSC和LUAD的鑒別作用，本研究通過qPCR對LUSC和LUAD組織中的CALML3 mRNA進行檢測發現，CALML3在LUSC組織和LUAD組織中的相對表達水平高于其癌旁正常組織，且CALML3在LUSC組織中的相對表達水平改變倍數是LUAD組織的3.653倍。此外，本研究發現CALML3在LUSC中的AUC為0.837，靈敏度為0.720，特異度為0.860，其能夠作為鑒別LUSC和LUAD的潛在生物標志物。

綜上所述，CALML3可作為鑒別LUSC和LUAD的一個潛在的生物標志物，但其在肺癌中的表達、功能及臨床實用價值有待進一步研究。后期也將繼續研究CALML3在肺癌患者血液及其他體液中的潛在價值，以明確CALML3的實際臨床應用，以及能否作為一個無創的生物標志物用于肺癌亞型的鑒別診斷。