液液萃取-全碳同位素標記-液質聯用法測定醬油中玉米赤霉烯酮

陽曦，劉瑋，向世杰

(1.綿陽市食品藥品檢驗所，四川 綿陽 621000；2.四川省農產品質量安全中心，成都 610000)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌產生的一類真菌毒素，在谷類和豆類及其制品中廣泛存在[1]。人或動物食用被玉米赤霉烯酮污染的食物后，會對健康造成一定危害，主要表現為生殖系統和免疫系統毒性[2-4]。世界衛生組織規定玉米赤霉烯酮的最大耐受量為0.5 μg/(kg·d)，我國GB 2761-2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》[5]中規定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量值為60 μg/kg。醬油的主要原料為大豆、小麥，均為受玉米赤霉烯酮污染的高風險作物。醬油在生產工藝上雖然有滅菌環節，但多采用高溫巴氏消毒法(85～90 ℃)進行，而玉米赤霉烯酮具有較強的耐熱性，在110 ℃以下加熱1 h以上才能完全被破壞。個別生產經營者對釀造用糧存僥幸心理，在原料上沒有嚴格把關，導致醬油產品中玉米赤霉烯酮超標。因此，非常有必要對醬油中的玉米赤霉烯酮進行檢測和控制。

文獻報道的玉米赤霉烯酮的檢測方法主要有酶聯免疫法[6]、薄層色譜法[7]、高效液相色譜法[8-9]、氣相色譜-串聯質譜法[10]、高效液相色譜-串聯質譜法等[11-12]。酶聯免疫法雖然靈敏度高，能夠達到1.0 μg/kg，但特異性差，陽性樣品需要進一步確證。薄層色譜法靈敏度較低，一般為0.1 mg/kg以上，同樣不能準確地定性。高效液相色譜法雖然具有較高的靈敏度(通常能達到1.0 μg/kg)，但樣品需要進行柱后衍生，分析時間長。氣相色譜-串聯質譜法同樣需要衍生化處理，且方法的穩定性差，應用并不廣泛。目前采用最多的是高效液相色譜-串聯質譜法，該方法選擇性強、靈敏度高、定量準確，是近年來測定真菌毒素的首選方法。免疫親和柱凈化為液相色譜-質譜聯用最常見的凈化方法，但該方法存在成本較高、耗時長等缺點。本文采用液液萃取法對目標物進行提取凈化，前處理步驟簡單，經高效液相色譜-串聯質譜法測定，內標法定量，實現了醬油中玉米赤霉烯酮的快速準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米赤霉烯酮標準溶液：100.0 μg/mL(乙腈)，青島Pribolab公司；13C18-Zearalenone標準溶液：25.0 μg/mL(乙腈)，青島Pribolab公司；乙腈(色譜純)：美國Thermo Fisher Scientific公司；甲醇、無水乙醇：分析純，成都市科隆化學品有限公司；三氯甲烷(分析純)：重慶川東化工有限公司。

樣品：市售醬油共18批。

U3000-4000 Q TRAP高效液相色譜-串聯質譜儀 美國AB SCIEX公司；ME204T/02電子天平 瑞士梅特勒-托利多有限公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 Zearalenone標準使用溶液的配制

精密吸取Zearalenone標準溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.00 μg/mL的標準使用溶液。

1.2.213C18-Zearalenone內標使用溶液的配制

精密吸取13C18-Zearalenone標準溶液1 mL置于5 mL容量瓶中，加50%乙腈稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為5.00 μg/mL的內標使用溶液。

1.2.3 樣品前處理

樣品經充分混勻后，稱取試樣5 g于50 mL離心管中，加入13C18-Zearalenone內標使用溶液40 μL，渦旋混合后靜置30 min。精密加入20 mL乙腈，渦旋5 min后以6000 r/min離心5 min，吸取上清液5 mL于氮吹管中，加入1 mL水、5 mL三氯甲烷，渦旋30 s后靜置分層，棄去上層溶液，下層溶液于50 ℃水浴中用氮氣吹干，加入1 mL 50%乙腈復溶，渦旋混勻，經0.22 μm水系濾膜過濾后，待測定。

1.2.4 空白基質溶液的制備

稱取空白基質樣品5 g于50 mL離心管中加入13C18-Zearalenone內標使用溶液40 μL，然后按1.2.3操作。

1.2.5 基質標準系列工作液

取Zearalenone標準使用溶液適量，用空白基質溶液制成濃度為5.0，25.0，50.0，75.0，100.0 ng/mL的基質標準系列工作溶液，每個濃度溶液中內標物13C18-Zearalenone的濃度為50 ng/mL。

1.2.6 液相色譜條件

色譜柱：Thermo Acclaim C18(3.0 mm×100 mm，3 μm)；流速：0.4 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：35 ℃；流動相A：乙腈，流動相B：水；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 The gradient elution conditions of liquidchromatography

1.2.7 質譜條件

電噴霧電離源(electrospray ionization, ESI)負離子模式；多反應監測(MRM)；離子化電壓：4500 V；離子源溫度：500 ℃；噴霧器壓力：55 psi；輔助加熱器壓力：50 psi；氣簾氣壓力：25 psi；其他參數見表2。

表2 質譜分析參數Table 2 Mass spectrometric analysis parameters

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

在ESI-模式下，通過外置針泵連續進樣，將濃度為1 μg/mL的ZEN和13C18-ZEN混合標準溶液泵入質譜儀。根據化合物的相對分子質量及分子結構特征，首先確定母離子的質荷比(m/z)，再調整碰撞能量，分別選擇兩個響應值大的碎片離子為子離子，以豐度最大的子離子為定量離子，豐度次之的子離子為定性離子，再分別優化碰撞能量和去簇電壓，得到MRM方法參數。

2.2 流動相的優化

本試驗比較了乙腈-水、乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液、甲醇-水、甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液作流動相的色譜行為。在動態調整流動相比例的梯度洗脫程序中，使目標化合物在各流動相體系中獲得最佳保留。結果表明，目標化合物在乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液體系中響應強度約為乙腈-水、甲醇-水體系的50%。以甲醇-水為流動相時，雖然目標化合物靈敏度較高，但是不能獲得較好峰形。以乙腈-水為流動相時，目標化合物的峰形最好且靈敏度高。因此，最終確定以乙腈-水為本試驗的洗脫溶劑。ZEN定量離子的MRM圖見圖1。

圖1 ZEN定量離子的MRM圖Fig.1 MRM diagram of quantitative ions of ZEN

2.3 提取溶劑的選擇

本試驗考察了乙腈、甲醇、乙醇作為提取溶劑對檢測結果的影響。樣品在20 μg/kg的添加濃度下，分別使用乙腈、甲醇、乙醇作提取溶劑，經三氯甲烷凈化后采用13C18-Zearalenone做內標進行定量。發現通過內標進行校正后，3組檢測數據回收結果相當，均高于90%，但是用乙腈作提取溶劑內標物的絕對回收率為72%，甲醇為61%，乙醇為60%，試驗結果見表3。從最后得到的待測溶液顏色來看，乙腈提取樣品后待測液為澄清透明的微黃色，甲醇和乙醇提取樣品后待測液為黃色，且乙醇提取樣品后待測液顏色最深，說明乙腈起到了較好的去除色素的作用。綜合考慮，最后選擇乙腈作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑對內標物回收率的影響Table 3 Effect of different extraction solvents on the recovery rates of internal standard substances

現行國標和文獻中常使用乙腈-水(9+1)[13-14]和乙腈-水(84+16)[15]作為提取溶劑。本試驗首先用乙腈提取目標物，發現乙腈與醬油完全分層，當在乙腈中加入部分水時，乙腈水提取溶劑會與醬油部分互溶，從而無法確定樣品的稀釋體積。因此，本試驗采用純乙腈作為提取溶劑，渦旋5 min進行充分提取，取得了較好的效果。

2.4 凈化方式的選擇

常用的真菌毒素提取液凈化方式為免疫親和柱凈化法[16-17]及固相萃取小柱凈化法[18]。這兩種方式的凈化效果雖然較好，但存在操作步驟繁瑣、消耗時間長、成本較高等問題，不利于大批量樣品的處理。本試驗采取液-液萃取的方法進行凈化，在提取液中加入三氯甲烷對目標物進行萃取，利用分配系數差異將乙腈中的目標物進行轉移，起到凈化作用。試驗比較了三氯甲烷為1，3，5，7 mL的凈化效率，當采用外標法定量時，目標物的回收率分別為60%、66%、75%、75%。因此，選擇三氯甲烷使用量為5 mL作為萃取用量。

2.5 基質效應及內標的選擇

本試驗通過比較溶劑匹配標準曲線和基質匹配標準曲線的斜率來判定基質效應[19]，按下式進行計算：

當ME<-20%時，表現為離子抑制；當-20%≤ME≤20%時，表現為弱基質效應；當ME>20%時，表現為離子增強。

結果表明，當采用外標法定量時，ME為-47%；當采用內標法定量時，ME為-27%，均表現為基質效應抑制。

在食品理化分析時，目標物在前處理過程中會有不同程度的損失，在樣品中加入與目標物化學性質相近的同位素內標，有助于校正樣品的前處理過程，同時也能校正儀器在進樣時引起的誤差。全13C同位素內標與目標物有相同的結構和化學性質，且色譜行為一致，基質效應相同，在提取時加入穩定同位素內標能夠反映樣品前處理的效率，校正進樣體積誤差，對質譜離子化效率進行補償，因此本試驗選擇13C18-Zearalenone作內標，并采用基質匹配標準曲線進行定量。

2.6 線性關系、檢出限、定量限

對空白基質系列標準溶液進樣測定，繪制工作曲線，計算回歸方程。以定量離子信噪比S/N=3時對應的濃度水平為檢出限，以定量離子信噪比S/N=10時對應的濃度水平為定量限，結果見表4。結果表明，在所測線性范圍內，ZEN具有良好的線性關系，檢出限、定量限均優于國家標準。

表4 玉米赤霉烯酮標準品回歸方程、相關系數、檢出限及定量限Table 4 The regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of ZEN

2.7 回收率及精密度

按試驗方法進行了3個水平的加標回收試驗，每個加標水平平行6次試驗，添加水平及結果見表5。結果表明，方法回收率為92.7%～96.0%，相對標準偏差小于3.0%，該方法具有良好的準確度和精密度。

表5 回收試驗結果(n=6)Table 5 The results of recovery test (n=6)

2.8 樣品的測定

對市售18批醬油以及原料用8批小麥、8批大豆按選定方法進行測定，結果18批醬油均未檢出ZEN，3批小麥檢出ZEN(3.5～41.3 μg/kg)，4批大豆檢出ZEN(8.2～22.8 μg/kg)，均未超過GB 2761-2017規定的谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量值60 μg/kg，說明生產企業在原料把控和生產工藝上控制良好。

對5批空白基質樣品添加標準溶液進行基質加標試驗，模擬陽性醬油樣本，加標水平為20 μg/kg，通過該方法進行測定，回收率分別為91.5%、98.7%、99.2%、90.6%和96.3%。

3 結論

本試驗建立了醬油中玉米赤霉烯酮的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，樣品經20 mL乙腈提取，5 mL三氯甲烷萃取凈化，用乙腈-水作流動相進行梯度洗脫，在負離子模式下進行多反應監測掃描，內標法定量測定樣品中玉米赤霉烯酮的含量，該方法玉米赤霉烯酮在5～100 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，回收率在90%以上，檢出限為0.1 μg/kg。該方法前處理簡單、靈敏度高、重復性好，能有效地滿足醬油中玉米赤霉烯酮的測定。