響應面法優化超聲波提取橘皮黃色素的工藝研究

李靚，朱涵彬，李長濱，潘春梅，岳曉禹，鄧真真

(河南牧業經濟學院 食品與生物工程學院，鄭州 450046)

近幾年來，現代食品工業對色素的需求越來越大，人工合成色素具有著色力強、色澤亮麗等優點，但會導致過敏、腹瀉、致癌等健康問題[1-2]，早已被大眾棄用，天然色素的安全系數高，成為未來主流發展趨勢已不可逆轉[3-4]。柑橘在中國的種植范圍較廣、資源豐富[5]，常以鮮果果肉食用，橘皮大多被丟棄，忽略其二次利用價值。橘皮中含有豐富的天然色素、多酚類[6-7]、黃酮類[8-9]、果膠類[10]等生物活性因子，尤其是橘皮中的黃色素，作為天然色素的一種，作為食品添加劑使用量越來越多[11]。隨著人們越來越注重食品的食用安全，渴望健康綠色的生活，又因橘皮黃色素良好的著色功能、獨特的保健功能，如抗氧化[12]、防衰老、調節免疫力、減脂[13]、減少心血管疾病發生[14]等功效，在生物、醫藥[15]等其他領域的應用也較為廣闊。

國內外對于黃色素的提取進行了較多研究，大多使用有機溶劑進行提取，操作過程復雜、費時費力、效率低[16]。超聲波輔助提取法[17-18]簡單快捷，提取率也比傳統的提取法大大提高，在工業推廣方面得到了廣泛的應用。為了研究橘皮黃色素，高效的提取率顯得尤為重要，本文擬利用超聲波法輔助提取橘皮黃色素，通過響應面試驗優化提高橘皮黃色素提取率，為橘皮黃色素的研究提供了有效的理論依據，為新功能產品的開發提供了技術指導。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮柑橘：購于鄭州市永輝超市；無水乙醇(分析純)：蘇州辰澤化工有限公司；石油醚(分析純)：南京化學工業園區；丙酮(分析純)：天津富宇精細化工有限公司；乙酸乙酯(分析純)：上海德榜化工有限公司。

1.2 儀器與設備

鼓風干燥箱 上海慧泰儀器制造有限公司；高速粉碎機 浙江榮浩工貿有限公司；電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司；循環水式多用真空泵 上海予申儀器有限公司；紫外分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橘皮的預處理

將新鮮的橘皮梗去掉并清洗干凈放在干燥的托盤上，在干燥箱溫度達到60 ℃時放入橘皮開始干燥，6 h后取出在高速粉碎機中立即粉碎。壓碎后的橘皮粉末通過40目篩后，放入真空袋中，置于陰涼干燥處備用。

1.3.2 黃色素提取溶劑的選擇

稱取橘皮粉末1.00 g于5個250 mL錐形瓶中，依次滴加蒸餾水、無水乙醇、石油醚、丙酮和乙酸乙酯各10 mL，在200 W的超聲功率下處理15 min，抽取濾液1 mL定容于25 mL容量瓶中并作空白對照，在190～540 nm處進行紫外光光譜掃描，確定并分析每種溶劑下的最佳吸收波長，從而得到最合適的提取劑。

1.3.3 單因素試驗條件設計

設置料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)、乙醇體積分數(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲時間(10，15，20，25，30 min)、超聲溫度(40，50，60，70，80 ℃)中3個因素固定的情況下，另1個因素的變化趨勢對提取黃色素的影響，探究最優因素條件。

1.3.4 響應面優化試驗設計

通過分析單因素試驗數據，選取料液比(A)、乙醇體積分數(B)、超聲時間(C)、和超聲溫度(D)4個因素為響應變量，以吸光度為響應值進行四因素三水平的響應面試驗。響應面試驗數據處理采用Design Expert 8.0.6軟件，響應面試驗設計因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素水平及編碼Table 1 The factors and levels of response surface experiment

2 結果與分析

2.1 黃色素提取溶劑的選擇結果

通過分析不同提取溶劑提取液的光譜掃描圖見圖1，得到黃色素的最大吸收波長在350 nm左右。丙酮、無水乙醇、蒸餾水和乙酸乙酯的提取效果都比較顯著，但是蒸餾水中所含成分較多，不適用于工業生產中黃色素的分離與提純，丙酮和石油醚屬于極易揮發的化學試劑且石油醚遇明火時會發生爆炸，而乙酸乙酯的價格比較昂貴，并有刺激性氣味，而無水乙醇具有價格低廉、方便回收等優點。綜合對比分析，本試驗選取無水乙醇為提取劑，通過選取該提取劑光譜掃描得到最大吸收波長348 nm，對該試驗進行吸光度測定。

圖1 不同提取溶劑的光譜掃描圖Fig.1 Spectral scanning of different extraction solvents

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 料液比對黃色素提取液吸光值的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按料液比(橘皮粉末和乙醇)為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25準確稱量無水乙醇，在溫度為40 ℃、超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲處理15 min，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對照，測定3次取其平均值，結果見圖2。

圖2 不同料液比對提取效果的影響Fig.2 Effect of different solid-liquid ratios on the extraction effect

由圖2可知，料液比在1∶10之前，隨著料液比的增加，吸光度值也增加；當料液比達到1∶10時，黃色素的提取液吸光度值達到最大，效果最佳；此后繼續增加料液比，吸光度值呈現下降的趨勢。因此，最佳料液比為1∶10 (g/mL)。

2.2.2 乙醇體積分數對黃色素提取液吸光度的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按乙醇體積分數為50%、60%、70%、80%和90%準確稱量，在溫度為40 ℃、超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲處理15 min，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對照，測定3次取其平均值，結果見圖3。

圖3 不同乙醇體積分數對提取效果的影響Fig.3 Effect of different ethanol volume fractions on the extraction effect

由圖3可知，當乙醇體積分數小于70%時，吸光度值隨著乙醇體積分數的增大而增加；當乙醇體積分數為70%時，橘皮黃色素提取液的吸光度最大；當乙醇體積分數大于70%時，吸光度值反而減少。因此，最佳乙醇體積分數為70%。

2.2.3 超聲時間對黃色素提取液吸光度的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按超聲時間為10，15，20，25，30 min進行操作，在溫度為40 ℃、超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對照，測定3次取其平均值，結果見圖4。

圖4 不同超聲時間對提取效果的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic time on the extraction effect

由圖4可知，在超聲時間小于15 min時，橘皮黃色素提取液的吸光度值最大。當超聲時間在10～15 min內，吸光度值隨著超聲時間的延長也在逐漸增大，黃色素的濃度不斷升高，但大于15 min，黃色素的吸光度值反而呈現逐漸下降的趨勢。因此，可以判定超聲時間15 min時提取效果最好。

2.2.4 超聲溫度對黃色素提取液吸光度的影響

稱取5份1.00 g橘皮粉末，按超聲溫度為40，50，60，70，80 ℃進行操作，在超聲功率為200 W的超聲波儀中超聲15 min，抽取1 mL濾液定容到25 mL的容量瓶中并作為空白對照，測定3次取其平均值，結果見圖5。

由圖5可知，提取液的吸光度值隨著溫度的升高而緩慢上升，當溫度達到70 ℃時繼續升高溫度則吸光度值呈緩慢下降趨勢，可能是溫度過高導致了部分黃色素的分解，所以綜合各方面來看，當提取溫度為70 ℃時提取效果最好。

2.3 響應面優化結果分析

2.3.1 響應面優化設計和結果

通過對單因素試驗結果進行分析，本試驗選擇料液比(A)、乙醇體積分數(B)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)作為響應因素，以提取液的吸光度作為響應值，進行橘皮黃色素提取的響應面優化試驗。響應面分析設計及試驗結果見表2。

表2 響應面分析設計與試驗結果Table 2 Response surface analysis design and experimental results

2.3.2 響應面模型的方差分析

響應面二次回歸方程方差分析的結果見表3，表3中料液比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度的P值均小于0.01，均達到極顯著水平。應用Design Expert 8.0.6軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到4個變量的二次回歸方程為：

Y=0.76-0.013A+0.017B+0.038C+0.031D-2.25×10-3AB-8.50×10-3AC+3.75×10-3AD-1.25×10-3BC+5.00×10-4BD+4.50×10-3CD-0.023A2-0.020B2-0.044C2-0.018D2。

式中：A代表料液比，B代表乙醇體積分數，C代表超聲時間，D代表超聲溫度。

表3 二次回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for quadratic regression equation

續 表

該方程的相關系數為R2=0.9685，即擬合出來的理論值與96.85%的實際數據是相對應的。由表3可知，本試驗失擬項并不顯著(P值>F值=0.1909>0.05，說明該方程對試驗擬合是合適的；且回歸方差模型較為顯著，P值>F值<0.0001。綜合分析可以得出該響應面試驗是有效可行的，且誤差較小。接下來對軟件處理出來的結果進行方差分析和顯著性的檢測。

2.3.3 提取工藝的響應面分析與優化

通過三維圖能較為全面地凸顯各影響因子間的交互作用并研究其相互影響力大小。其中三維圖中呈現了各影響因子間在變化過程中響應值的變化狀態，若圖中曲面波動幅度較小則說明該因素對響應值的影響較小，反之若波動幅度大則影響較大。

圖6 乙醇體積分數和料液比對吸光度的影響Fig.6 Effect of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on absorbance

由圖6可知，當乙醇體積分數固定時，隨著料液比的增加，吸光度值發生了先上升后下降的變化；當料液比固定時，隨著乙醇體積分數的增加，吸光度值呈現變化緩慢的拋物線趨勢。兩者相比較，乙醇體積分數對吸光度值的影響大于料液比。在料液比1∶10時選擇體積分數70%的乙醇得到最大響應值。

圖7 超聲時間和料液比對吸光度的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and solid-liquid ratio on absorbance

由圖7可知，在乙醇體積分數為70%、超聲溫度為70 ℃時，超聲時間對吸光度的影響比料液比更加明顯，在料液比一定的情況下，隨著超聲時間的增加，黃色素提取液的吸光值也不斷增加，但是當增加到一定程度時速度趨于平緩。

圖8 超聲溫度和料液比對吸光度的影響Fig.8 Effect of ultrasonic temperature and solid-liquid ratio on absorbance

由圖8可知，選擇70%的乙醇超聲15 min時，超聲溫度比料液比的變化曲度大，隨著溫度的升高，提取液的吸光度值也不斷增大，但是當溫度增加到一定值時，吸光度的變化就不再明顯，可能是由于溫度過高造成了色素的損失。

圖9 超聲時間和乙醇體積分數對吸光度的影響Fig.9 Effect of ultrasonic time and ethanol volume fraction on absorbance

圖10 超聲溫度和乙醇體積分數對吸光度的影響Fig.10 Effect of ultrasonic temperature and ethanol volume fraction on absorbance

圖11 超聲溫度和超聲時間對吸光度的影響Fig.11 Effect of ultrasonic temperature and ultrasonic time on absorbance

結合圖6～圖11和表3中的F值可知，本試驗中超聲時間對提取效果的影響最大，且各個因素對試驗結果的影響順序由大到小依次為：超聲時間>超聲溫度>乙醇體積分數>料液比。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗證試驗

通過Design Expert 8.0.6軟件求解方程，可以得到最優的理論值是料液比1∶9.93，選擇乙醇體積分數71.45%、超聲時間17.52 min和超聲溫度71.26 ℃。考慮到做試驗的實際情況，也為了方便操作，將理論最佳條件確定為1∶10的橘皮與乙醇之比，71%的乙醇濃度，71 ℃下超聲18 min。

為了檢驗試驗結果是否可靠，按照本試驗操作流程在該條件下進行3次平行試驗，測得的吸光度值求平均值為0.759，與響應面法預測的最優結果0.770基本吻合，因此采用響應面法對橘皮中黃色素的超聲波提取工藝優化可行且效果較為良好。

3 結論

本試驗采用超聲波輔助提取橘皮中黃色素，通過常用提取溶劑的對比篩選確定乙醇為提取劑，在考察固液比(g/mL)、乙醇體積分數(%)、超聲溫度(℃)和超聲時間(min)單因素的基礎上進行響應面優化，得出橘皮粉末和70%的乙醇最佳比例是1∶10，最適合的乙醇體積分數為71%，最恰當的超聲時間是18 min，超聲溫度在71 ℃時提取效果最好，在最優條件下提取的橘皮黃色素含量是17.8%，提取效果較好，為橘皮的綜合加工開發提供了理論數據，為深入研發橘皮黃色素生產提供了理論技術指導。