米曲霉功能基因組-蛋白組學研究及其在發酵生產中的應用

錢曉慶，黃煌，陳茂彬，周冉冉，李可心，張玉*

(1.湖北工業大學 生物工程與食品學院 發酵工程教育部重點實驗室，武漢 430068；2.工業發酵湖北省協同創新中心，武漢 430068；3.工業微生物湖北省重點實驗室，武漢 430068)

米曲霉(Aspergillusoryzae)是一種好氣性絲狀真菌，歸屬于真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、從梗孢科、曲霉屬。米曲霉是通過孢子繁殖，發芽后長出菌絲，其菌絲在生長初期呈白色，在生長后期呈黃綠色，老化后逐漸變為褐色[1-2]。分生孢子梗生長在足細胞上，分生孢子頭一般呈放射狀，少數為疏松柱形，頂囊呈球形或燒瓶形[3]。米曲霉菌落生長速度快、質地疏松，最適生長溫度為30～35 ℃，產酶最適宜溫度為28～30 ℃；相對濕度保持在95%左右比較合適；生長的最適pH是6.0左右，偏高或偏低，均不利于米曲霉的菌體中酶的分泌，同時也會影響酶的活力。

米曲霉作為一種絲狀真菌在傳統發酵食品生產中發揮著重要的作用[4]，是酒類釀造、醬類及醬油生產的核心菌株。米曲霉主要通過分泌蛋白酶[5-6]、淀粉酶[7]、糖化酶[8]、纖維素酶[9]等酶類對原料中的蛋白質、多糖、纖維素等大分子物質進行降解，從而提高發酵制品的風味。目前，工業用酶的50%由絲狀真菌生產[10]，尤其是食品酶和飼料酶[11]。米曲霉易培養，不分泌黃曲霉毒素，1989年美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料公司協會認定米曲霉為安全微生物菌種(generally regarded as safe， GRAS)[12]。隨著食品工業的發展，利用米曲霉等絲狀真菌作為表達宿主生產蛋白酶、糖化酶和淀粉酶等工業酶制劑的研究也愈發廣泛。

我國人口眾多，對發酵制品的需求量較大，因而成本和品質成為較為關注的問題，為獲得性狀優良的米曲霉菌株，更好地應用于傳統釀造食品，菌種的選育和改良在現代發酵菌種技術中處于重要地位。目前我國傳統釀造行業中一般是通過測定最終酶活力來反映發酵性能，從而選育優良的米曲霉菌株，人們對于米曲霉分泌的酶系以及相關基因的調控也有一定的研究，但系統性的深入研究并不多。本文通過綜述米曲霉功能基因組學、蛋白組學以及在發酵領域中的應用研究進展，以期為后續米曲霉的研究提供指導。

1 米曲霉功能基因組學的研究進展

功能基因組學是利用基因組項目產生的大量數據來描述基因和蛋白質的功能和相互作用[13]。米曲霉在釀造工業中的重要應用以及高效的胞外蛋白分泌能力與其相關基因的調控是分不開的，研究表明米曲霉基因組中有135個胞外蛋白酶基因。全基因組序列的破譯為米曲霉基因組改組技術提供了基礎。Machida等成功破譯了米曲霉RIB40的基因組，研究發現米曲霉基因大小為37.9 Mb，大約有3800萬堿基對，8條染色體，長度分別為3.3，3.4，4.1，4.4，4.8，5.0，6.2，6.4 Mb，約1.2萬個基因[14]。表達序列標簽(EST)技術和DNA微矩陣技術的應用促進了米曲霉功能基因組學的發展。目前，大約有10個米曲霉菌株已被測序并存入公共NCBI數據庫，這些菌株的基因組大小從35.42～41.16 Mb不等，在1.2萬個左右基因中，只有約200個基因功能被鑒定。對米曲霉基因組基因進行GO功能聚類分析發現，在分子功能方面，水解酶活性、氧化還原酶活性和轉運酶活性處在前列；在細胞組分方面，細胞核、膜和細胞質位于前三名；在生物過程方面，大量基因參與了糖類、蛋白質、脂類代謝以及分泌蛋白加工轉運等過程[15]。米曲霉基因組中雖然大多數量基因是未知的，但是從基因組注釋來看，米曲霉適合作為良好的宿主細胞用于工業化生產。根據基因組所包含的信息來控制米曲霉發酵，從而提高食品釀造業的生產效率和產品質量[16]。

米曲霉遺傳轉化系統的建立為進一步從基因水平深入研究和基因改良菌株提供了條件。Zhao等[17]通過比較米曲霉RIB40和米曲霉3.042基因組與轉錄組的數據差異，發現了2種米曲霉不同的分泌調控機制，在米曲霉3.042菌株中發現了更多的與細胞生長和環境抗性相關的基因，該菌株具有更強的生命力；而米曲霉RIB40特有的Na+、K+、甘油代謝相關基因較多，該菌株耐鹽脅迫能力較強。在兩個菌株中觀察到許多編碼酶的基因，這些酶對不同的醇、酸和氨基酸的產生有重要影響，在基因水平上分析了兩種米曲霉用于發酵產品產生不同風味的原因。He等[18]通過對米曲霉不同生長階段的轉錄組分析，揭示了不同類型基因在生長過程中的動態變化，利用RNA-seq分析了米曲霉的3個階段，每個樣本產生了2700多萬個高質量讀段。分析結果顯示，從適應期向對數期和穩定期過渡時，差異基因表達較多，而從對數期向穩定期過渡時，差異基因表達相對穩定。對米曲霉基因組基因進行了GO功能聚類分析，對不同生長階段的差異表達基因進行了分類，發現這些基因大多在單生物過程、代謝過程和催化活性方面得到了富集。從適應期向對數期轉化時大多數基因表達增加，從對數期向靜止期的穩定表達主要涉及碳水化合物和氨基酸的代謝，這對米曲霉在發酵領域的作用從基因層面進行了解釋。

分析米曲霉分泌的各種酶的表達基因，將米曲霉進行遺傳改造使其成為更加優良的菌種，已經成為米曲霉研究工作的重要內容。傳統的米曲霉菌種改造有化學誘變、物理誘變、原生質體融合法等方法，通過采用常壓室溫等離子體誘變改良米曲霉菌株[19-20]，對比研究發現突變株產酶能力增強，酶活力均有所提高，氨基酸和還原糖的含量也顯著提高，大大提升了釀造制品的品質。Cheevadhanarak等[21]應用寡核苷酸探針技術，從基因文庫中獲得了米曲霉堿性蛋白酶基因，并對該基因的序列進行了分析和測定，將該蛋白酶基因轉化到米曲霉中，轉化株分泌的蛋白酶量為初始菌株的6倍。

新興發展的選擇性標記基因應用技術、染色體大片段刪除技術和DNA芯片技術等為米曲霉存在的mRNA的不穩定[22]、自身蛋白酶分解錯誤折疊的外源蛋白等不足提供了改善方法[23]，利用基因工程技術對菌株進行改造，如關鍵酶基因的超表達、代謝通路的激活、競爭通路的抑制，可顯著提高米曲霉的生產能力。

通過基因組測序得到的編碼蛋白大部分是功能未知的蛋白，功能基因組學與蛋白質組學聯合應用，可以對米曲霉功能性蛋白進行更深層次的研究，為獲得更多目的蛋白信息提供了研究思路和基礎。

2 米曲霉蛋白組學的研究進展

米曲霉作為絲狀真菌，其分泌物由高度動態的蛋白質組成，包括多種活性酶。蛋白組學是研究特定條件下蛋白質整體水平的存在狀態及活動規律，主要包括蛋白質樣品的制備、分離以及最終的鑒定。目前，米曲霉蛋白質組主要集中在相關功能性蛋白的表達情況上，雙向電泳技術(two-dimentional electrophoresis，2-DE)及基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術的發展已經廣泛應用于蛋白質組分的分析。

Hayakawa等[24]利用淀粉酶-綠色熒光融合蛋白(AmyB-EGFP)，熒光觀察發現米曲霉胞外蛋白酶系參與分泌途徑主要分布于菌絲頂端，通過頂端分泌的方式分泌至胞外[25]。且在米曲霉中，同源蛋白分泌量可超過10 g/L，而非真菌異源蛋白的表達量很低。Oda K等[26]運用雙向凝膠電泳技術，利用基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜技術，通過肽質量指紋圖譜比較了米曲霉RIB40在固體和液體培養條件下胞外蛋白的分泌情況，共鑒定出包括淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、纖維素降解酶在內的29種蛋白。劉曄等[27]以米曲霉ZJGS-LZ-12為研究對象，以米曲霉3.042為對照，運用雙向電泳技術及生物質譜檢測。研究發現米曲霉ZJGS-LZ-12與米曲霉3.042胞外分泌蛋白組存在顯著差異，差異表達蛋白點共169個，主要是淀粉水解酶、纖維素酶、半纖維素酶及蛋白質酶，其中，淀粉水解酶、半纖維素酶活性顯著增強，這些酶參與糖類和蛋白質水解過程，有利于豆制品的發酵生產。

在定性地明確米曲霉的分泌蛋白后，研究人員在已有的基礎上進一步檢測不同條件下米曲霉所產生的酶的酶學性質和活性，毛丙永等[28]從米曲霉3.042中分離純化得到一種耐鹽蛋白酶，并鑒定為鈣蛋白酶RIM13，該蛋白酶在高鹽度環境下仍具有較高的酶活力，在醬油的發酵生產中具有較大的應用潛力。Zhao等[29]采用2-DE技術比較米曲霉100-8(米曲霉3.042注入N+誘變而來)和米曲霉3.042的蛋白組學差異，鑒定出522個胞內蛋白，其中451個為差異蛋白點，在米曲霉100-8中，細胞內肽酶、糖酵解酶、tRNA合成酶、乙醇脫氫酶、丙酮酸脫羧酶、硫胺生物合成酶等含量較高，它們參與糖酵解、氨基酸合成代謝、次級代謝過程，這些蛋白與釀造醬油的風味相關，有助于增強醬油的風味。國內釀造行業普遍使用的醬油菌種是米曲霉滬釀3.042，產生的蛋白酶以中性蛋白酶和堿性蛋白酶為主，黑婷婷等[30]采用離子注入法誘變經選育得到的A100-8菌株，其纖維素酶、糖化酶、蛋白酶活力較原菌種均有提高，有利于后續食品發酵的運用。

目前對米曲霉蛋白質功能的研究較少，已知功能的蛋白，它們的功能大多數是利用同源基因功能類推的方法推測出來的，米曲霉分泌蛋白的編碼基因部分見表1，從米曲霉分泌的蛋白質入手，有助于更深一步了解基因組并闡明基因的功能，從而更加清晰地了解米曲霉的特性。

表1 米曲霉部分胞內胞外蛋白的編碼基因Table 1 Genes encoding of some intracellular and extracellular proteins in Aspergillus oryzae

3 米曲霉在發酵制品領域的應用

米曲霉是一種高產復合酶的菌株，分泌包括蛋白酶在內的多種酶類。按照米曲霉所分泌酶的酶活不同，將其在發酵領域的應用分為兩類：一種是分泌高活性的糖化酶，另一種是分泌高活性的蛋白酶。

高活性糖化酶分解淀粉質原料的能力強，把含淀粉和糖質原料的物質進行發酵產生酒精，這種米曲霉一般用于酒類釀造[31-32]。趙中開等[33]通過優化純種米曲霉酒曲的制備工藝，使得米曲酶糖化酶活力顯著提高到1110.79 U/g，為米曲霉酒曲的規模化生產提供了理論依據。葛祎楠等[34]以板栗作為釀酒原料，通過對4種米曲霉酒曲的感官評價及酶活進行測定，發現米曲霉2011作為板栗清酒的糖化曲種，其α-淀粉酶活力為1306.63 U/g，糖化酶活力為324.56 U/g，酸性蛋白酶活力為1036.33 U/g，顯著改善了清酒的風味和營養價值。

高活性的蛋白酶分解蛋白質的能力強，在醬類[35-37]及醬油[38-39]釀造中運用較多。黃艷等以米曲霉A019為出發菌株，采用常壓室溫等離子體誘變選育得到突變株ZA131，該突變株生長較快，菌絲較長而孢子較少，產酶能力增強，尤其是蛋白酶提升了38.46%，谷氨酰胺酶提升了18.25%，谷氨酸生成率提升了11.18%，對醬油釀造風味的提升有顯著貢獻；丁昊等[40]從米曲霉HDF-7中分離純化獲得的蛋白酶對大豆蛋白進行水解，發現氨基酸含量提高了18.2%，將純化的蛋白酶加入原料中代替制曲，大大縮短了制醬時間。

米曲霉廣泛用于酒類、醬類及醬油的發酵生產，不僅直接關系到原料利用率的高低，還進一步影響到發酵速度的快慢、成品的品質及風味等。因此，通過對米曲霉的功能基因組和蛋白組綜合比較分析研究，對米曲霉基因組-蛋白質組信息及功能有了更加清晰的認識，對傳統發酵食品的滋味、風味、色澤的調控具有重要理論價值。

4 結論

米曲霉是我國傳統食品釀造行業中的核心菌株，是豆豉、醬油、清酒、黃酒等食品的關鍵發酵菌種，米曲霉主要通過分泌蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等酶類對原料中的蛋白質、多糖、纖維素等大分子物質進行降解，提高發酵制品的品質。米曲霉全基因組序列已經被破譯，但仍有大多數基因功能尚不明確，因而運用基因組學遺傳改造技術來改良米曲霉菌株存在諸多限制和障礙。蛋白質作為生命活動的承擔者，其種類和表達量都是特定情況下基因選擇性表達的結果，因此將功能基因組-蛋白質組學結合起來分析，能夠更加準確地闡述米曲霉機體的內部調控和反應機理，將有助于我們更加深入理解米曲霉酶系表達和酶蛋白分泌的調控機制，為有針對性地選育高蛋白酶活和高糖化酶米曲霉菌株提供了理論基礎，從而有效地提升發酵制品的質量并降低生產過程中的成本，為米曲霉在食品行業的深度開發利用提供一定的技術參考。