抗白細(xì)胞介素6受體的活性成分虛擬篩選及其核心中藥干預(yù)新冠肺炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制探討

吳 堅(jiān)，張錫洪，徐文堅(jiān)

（1.廣東省汕頭市中心醫(yī)院，廣東 汕頭 515031； 2.廣東省中山市小欖人民醫(yī)院，廣東 中山 528400）

發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀是新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）感染初期的臨床表現(xiàn)，重癥患者可出現(xiàn)呼吸困難與低氧血癥，甚至發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征等[1]。目前尚無特效藥物及疫苗，臨床針對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染患者的治療，多數(shù)沿用既往冠狀病毒感染的臨床治療經(jīng)驗(yàn)[2]。炎性風(fēng)暴由于機(jī)體的免疫系統(tǒng)應(yīng)答過于強(qiáng)烈，大量釋放細(xì)胞因子對(duì)肺組織造成損傷，是致使患者病情惡化甚至死亡的重要原因[3]。COVID-19患者由于后期機(jī)體產(chǎn)生炎性風(fēng)暴導(dǎo)致多器官衰竭而死亡。參考文獻(xiàn)[4]分析了COVID-19患者的特征，發(fā)現(xiàn)患者特別是重癥患者的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著降低，炎性因子白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）等水平均顯著升高。IL-6是與炎性反應(yīng)關(guān)系最密切的炎性因子，常在急慢性炎性部位產(chǎn)生，通過與IL-6受體（IL-6R）結(jié)合誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄炎性應(yīng)答，刺激更多細(xì)胞因子產(chǎn)生，參與炎性風(fēng)暴[5]。IL-6/IL-6R的結(jié)合效應(yīng)引發(fā)蛋白酪氨酸激酶（JAK）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT3）、白細(xì)胞介素17A（IL-17A）、磷脂酰肌醇3-激酶-蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）、轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）、Toll樣受體（TLR）等下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[6-7]，其信號(hào)通路的激活會(huì)刺激IL-6靶向應(yīng)答基因的表達(dá)，在信息傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)、炎癥、血管生成、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用。此外，低氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）信號(hào)通路靶向調(diào)控B細(xì)胞分泌IL-6，影響T細(xì)胞分化[8]。該過程參與免疫調(diào)控，和機(jī)體的炎癥密切相關(guān)。IL-6可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），VEGF可提高血管的通透性，促使炎性細(xì)胞滲出[9]。血管形成和炎性反應(yīng)是2個(gè)相互依賴的過程。上述因子間相互調(diào)節(jié)，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)組織炎癥的發(fā)生和發(fā)展。目前，我國發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》[10]已明確將IL-6水平上升作為病情惡化的臨床警示指標(biāo)，采用糖皮質(zhì)激素作為免疫抑制劑治療炎性風(fēng)暴，用于遏制重癥患者的免疫激化反應(yīng)，但糖皮質(zhì)激素的使用可能會(huì)降低機(jī)體抗病毒的能力，造成二次感染、病程延長及骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等不良預(yù)后，且存在嚴(yán)重后遺癥風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[11]。

我國中醫(yī)藥在治療SARS-CoV-2感染、COVID-19患者中發(fā)揮了重大作用。中藥“多成分-多靶點(diǎn)-多效應(yīng)”的整體治療特點(diǎn)使其在疾病防治方面具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力。中藥成分復(fù)雜，中藥單體作為中藥發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，挖掘和篩選中藥單體具有重要意義。目前尚缺乏抗COVID-19炎性風(fēng)暴相關(guān)機(jī)制研究的文獻(xiàn)報(bào)道，且尚未系統(tǒng)闡明中藥各組分及其治病機(jī)理。隨著各種高通量多組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)為探索中藥的科學(xué)依據(jù)提供了新策略[12]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在系統(tǒng)藥理學(xué)和生物信息學(xué)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的基礎(chǔ)上通過計(jì)算、分析與預(yù)測(cè)的研究方式將中藥及其成分和疾病生物網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來，以期挖掘和發(fā)現(xiàn)藥效物質(zhì)及其潛在的治病機(jī)制[13]。分子對(duì)接技術(shù)通過化學(xué)計(jì)量學(xué)方法模擬受體和配體間的相互作用，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)兩者結(jié)合的可能性，還可根據(jù)兩者的結(jié)合情況優(yōu)化受體和配體的結(jié)構(gòu)，為藥物篩選及設(shè)計(jì)提供新思路[14]。本研究中針對(duì)臨床報(bào)道的與炎性風(fēng)暴最密切的IL-6R，利用分子對(duì)接技術(shù)對(duì)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）中的天然小分子進(jìn)行高通量挖掘，虛擬篩選出IL-6R的天然小分子抑制劑，并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)富集IL-6R天然小分子抑制劑最多的核心中藥干預(yù)COVID-19的作用機(jī)制，為新藥開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 小分子數(shù)據(jù)庫的建立

基于TCMSP數(shù)據(jù)庫，納入2015年版《中國藥典（一部）》收錄的499種中藥及其含有IL-6R天然小分子抑制劑的化合物共13 143個(gè)，下載化合物的MOL2格式3D結(jié)構(gòu)的文件，建立分子對(duì)接技術(shù)虛擬篩選的小分子數(shù)據(jù)庫。

1.2 基于ADME和Lipinski規(guī)則的評(píng)估

基于ADME參數(shù)[15]即口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18，以及Lipinski規(guī)則[16]即相對(duì)分子質(zhì)量（MW）＜500、脂水分配系數(shù)（clogP）＜5、氫鍵給體數(shù)目（Hdon）＜5，對(duì)小分子抑制劑數(shù)據(jù)庫的活性成分進(jìn)行初步篩選，篩選藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)和OB良好的化合物，以減少陰性結(jié)果出現(xiàn)的概率，從結(jié)構(gòu)和性質(zhì)角度過濾成藥性較低的化合物，以提高篩選效率。

1.3 分子對(duì)接

在RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）網(wǎng)站中下載IL-6R（1N26）的3D結(jié)構(gòu)文件，通過Raccoon軟件對(duì)小分子進(jìn)行加氫、加電荷、移除非極性氫、刪除孤對(duì)電子，以及建立特殊可旋轉(zhuǎn)鍵等批量預(yù)處理。采用Discovery studio 2.5軟件將1N26中的配體/底物清除，并獲得IL-6R。據(jù)報(bào)道，Phe229 and Phe279兩個(gè)氨基酸殘基不僅是IL-6R的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)[17-19]，也是目前IL-6R的研究熱點(diǎn)。因此，以Phe229和Phe279兩個(gè)氨基酸殘基在IL-6R中的位置設(shè)置用于本研究中分子對(duì)接的結(jié)合口袋。運(yùn)用Autodock Vina和Python腳本完成高通量分子對(duì)接，根據(jù)每個(gè)化合物的最優(yōu)結(jié)合能進(jìn)行排序，若結(jié)合能小于0，則說明配體和受體可自發(fā)結(jié)合，目前分子對(duì)接結(jié)果的篩選尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，以結(jié)合能≤-20.92 kJ/mol作為對(duì)接依據(jù)[19]，為提高結(jié)果的可靠性，以結(jié)合能≤-25.10kJ/mol作為篩選潛在活性成分的對(duì)接依據(jù)。

1.4 成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及其抗COVID-19靶點(diǎn)確認(rèn)

將核心中藥的潛在活性成分導(dǎo)入TCMSP數(shù)據(jù)庫中，獲得成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，將潛在靶點(diǎn)進(jìn)一步映射到Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，并轉(zhuǎn)換為官方名稱（gene symbol）。檢索OMIM和GeneCard數(shù)據(jù)庫有關(guān)COVID-19的相關(guān)靶點(diǎn)，將成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線服務(wù)器中，獲得兩者的交集部分，即為核心中藥干預(yù)COVID-19發(fā)生、發(fā)展的潛在靶點(diǎn)，并將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中獲得蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析

將預(yù)測(cè)核心中藥對(duì)有效成分的潛在靶點(diǎn)提交到生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8進(jìn)行GO基因功能注釋和KEGG通路富集分析，以預(yù)測(cè)核心中藥的分子機(jī)制。

1.6 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將核心中藥的活性成分、潛在靶點(diǎn)及相關(guān)通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，以構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，闡釋其多效協(xié)同的作用特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 基于ADME和Lipinski規(guī)則的評(píng)估

13 143個(gè)化合物中，2 454個(gè)成分滿足要求，即OB≥30%且DL≥0.18。在符合ADME性質(zhì)的基礎(chǔ)上，1 511個(gè)成分同時(shí)符合ADME和Lipinski規(guī)則的要求，共涉及372個(gè)中藥，提示上述成分具有良好的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)、OB及OL。

2.2 分子對(duì)接

2.2.1 與IL-6R對(duì)接結(jié)合能在不同區(qū)間的分析

初篩結(jié)果顯示，分子對(duì)接數(shù)據(jù)顯示結(jié)合能在（-25.10，0]kJ/mol區(qū)間的成分有624個(gè)，在（-29.29，-25.10]kJ/mol區(qū)間的成分有800個(gè)，在（-33.47，-29.29]kJ/mol區(qū)間的成分有86個(gè)，結(jié)合能小于-33.47 kJ/mol的成分僅1個(gè)，提示存在87個(gè)成分具有較強(qiáng)且穩(wěn)定的結(jié)合結(jié)果，說明上述成分具有良好的開發(fā)潛能。其中，芝麻素（sesamin）與IL-6R的結(jié)合最好，提示該化合物具有良好的開發(fā)潛能，由于數(shù)據(jù)較多，因此本研究僅展示結(jié)合能小于-29.29 kJ/mol的結(jié)果。詳見表1。

2.2.2 成分和中藥分布情況

由表1可知，結(jié)合能小于-25.10 kJ/mol的成分共887個(gè)，通過TCMSP進(jìn)行成分的中藥歸屬分析見圖1。6味清熱藥板藍(lán)根、白屈菜、苦地丁、苦參、赤芍、關(guān)黃柏，4味活血化瘀藥丹參、延胡索、沒藥、桃仁，3味止咳平喘藥百部、桑白皮、洋金花，3味補(bǔ)益藥甘草、枸杞子、靈芝，2味理氣溫理藥枳實(shí)、吳茱萸，化瘀止血藥降香，1味祛風(fēng)濕散寒藥雷公藤。其中，甘草含有IL-6R天然小分子抑制劑成分最多，主要包括多糖類、黃酮類、三萜類等，提示甘草在干預(yù)COVID-19中發(fā)揮著重要作用。

圖1 活性成分整體富集15個(gè)及以上的中藥Fig.1 Traditional Chinese medicine with overall enrichment of 15 or more active components

結(jié)合能小于-25.10 kJ/mol的成分中，能富集10種中藥以上的成分有16個(gè)（見表2）。其中，木犀草素富集的中藥種類最多，為90種。說明木犀草素來源廣泛，且其與IL-6R也有較好的結(jié)合。16個(gè)化合物中，多數(shù)為黃酮類化合物，說明黃酮類化合物在天然藥物中廣泛存在，提示該類成分在抑制IL-6R活性上具有良好的開發(fā)潛能。

表2 整體成分富集10種中藥以上的成分Tab.2 Components with more than 10 traditional Chinese medicines enriched in overall components

由表1可知，與IL-6R的結(jié)合能小于-29.29kJ/mol的87個(gè)成分中，能富集4種中藥以上的成分有9個(gè)（見圖2）。其中，富集藥材數(shù)量排名前3的成分分別為MOL001458-黃連堿（9味中藥）、MOL001558-芝麻脂素（7味中藥）、MOL007180-維生素E（8味中藥），其中芝麻脂素與IL-6R的結(jié)合最強(qiáng)，來源廣泛。

圖2 篩選關(guān)鍵成分（能富集4種以上的中藥）的網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network for screening key components（capable of enriching more than four kinds of traditional Chinese medicines）

表1 與IL-6R對(duì)接結(jié)合能小于-29.29 k J/mol的成分Tab.1 Components with docking binding energy less than-29.29 k J/mol with IL-6R

包含4個(gè)及以上活性成分的中藥有7味（見圖3），包含成分?jǐn)?shù)量排名前3的中藥分別為甘草（10個(gè)成分）、苦地丁（8個(gè)成分）、白屈菜（6個(gè)成分）。可見，甘草不僅是與IL-6R結(jié)合能小于-25.10kJ/mol化合物最多的中藥，還是與IL-6R結(jié)合能小于-29.29 kJ/mol化合物最多的中藥，提示甘草在抑制IL-6R中具有良好的潛在活性。

圖3 篩選核心中藥（包含活性成分不少于4個(gè)）的網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Network for screening core traditional Chinese medicine（including no less than four active components）

2.3 甘草干預(yù)COVID-19的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制分析

潛在靶點(diǎn)：甘草為治療COVID-19的核心中藥，共獲得82個(gè)甘草對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，259個(gè)COVID-19相關(guān)靶點(diǎn)，將兩者的靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，獲得16個(gè)甘草干預(yù)COVID-19的潛在靶點(diǎn)。結(jié)果見圖4。

圖4 甘草治療COVID-19的潛在靶點(diǎn)Fig.4 Potential targets of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma against of COVID-19

KEGG通路富集分析：甘草干預(yù)COVID-19的通路可視化結(jié)果見圖5。圖中顯示了排名前20的信號(hào)通路，16個(gè)潛在靶點(diǎn)參與的信號(hào)通路主要與免疫與炎癥、癌癥、慢性疾病等密切相關(guān)，包括HIF-1 signalingpathway、VEGFsignaling pathway、血小板活化（Platelet activation）、Pathways in cancer、TNF signaling pathway等79條，P＜0.01的通路有63條。其中，HIF-1，VEGF，Platelet activation，TNF，PI3K-Akt，IL-17，TLR信 號(hào) 通 路 與COVID-19的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，提示甘草可能通過上述通路發(fā)揮抗COVID-19的作用。甘草干預(yù)COVID-19的GO生物功能注釋結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，16個(gè)靶點(diǎn)主要注釋了7個(gè)方面的生物功能，包括胸腺發(fā)育（thymus development）、花生四烯酸代謝過程（arachidonic acid metabolic process）、肌肉收縮的負(fù)調(diào)節(jié)（negative regulation of muscle contraction）、超氧化物代謝過程（superoxide metabolic process）、脂多糖類介導(dǎo)的信號(hào)通路（lipopolysacchiaride-mediated signalingpathway）、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)（regulation of blood vessel endothelial cell migration）、細(xì)胞氧化劑排毒（cellular oxidant detoxification），上述功能主要與免疫調(diào)節(jié)、炎性干預(yù)、氧化應(yīng)激、抗凝與凝血系統(tǒng)調(diào)控等生物過程的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

圖6 GO生物功能注釋Fig.6 GO biological function annotation

潛在“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：為了闡釋甘草干預(yù)COVID-19生物網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜分子機(jī)制，本研究篩選通路中P值排名前20的通路，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果見圖7。該網(wǎng)絡(luò)中共含有98個(gè)節(jié)點(diǎn)，其中有62個(gè)成分（紅色）、16個(gè)靶點(diǎn)（黃色）、20條通路（綠色），上述節(jié)點(diǎn)共構(gòu)成了578條關(guān)系，其中靶點(diǎn)與成分之間存在400條關(guān)系，靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間存在65條關(guān)系，靶點(diǎn)與通路之間存在113條關(guān)系，提示甘草的作用靶點(diǎn)不僅在一定程度上相互影響，還分布于不同的通路上，充分體現(xiàn)了中藥治療疾病是“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”相互協(xié)調(diào)的共同結(jié)果。

圖7 甘草抗COVID-19的潛在“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig.7 Potential″component-target-pathway″network of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma against COVID-19

3 討論

COVID-19屬中醫(yī)“濕毒疫”范疇，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳、乏力、咽痛等。感染病毒后，機(jī)體在對(duì)抗病毒過程中產(chǎn)生大量氧自由基和炎性因子，破壞支氣管及肺泡中的上皮-內(nèi)皮屏障，造成肺泡-毛細(xì)血管氧傳遞功能障礙和氧擴(kuò)散能力受損，致使重癥COVID-19患者出現(xiàn)呼吸困難與低氧血癥，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重的凝血功能障礙及形成血栓，易導(dǎo)致患者并發(fā)膿毒血癥及發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征，直至后期機(jī)體產(chǎn)生炎性風(fēng)暴導(dǎo)致多器官衰竭乃至死亡。面對(duì)COVID-19發(fā)生與發(fā)展的復(fù)雜多變性，在中醫(yī)辨證施治的理論指導(dǎo)下，中藥的整體療效具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。為促進(jìn)天然分子的高效開發(fā)與利用，探討中藥抗COVID-19的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制意義重大。故本研究中在多項(xiàng)研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)高通量的虛擬篩選，獲得了符合ADMELipinski規(guī)則且與IL-6R結(jié)合較好的IL-6R天然小分子抑制劑887個(gè)，其中結(jié)合最強(qiáng)的是芝麻素。本研究中篩選獲得的IL-6R天然小分子抑制劑多數(shù)為黃酮類成分，其中來源最廣的為木犀草素；多數(shù)IL-6R天然小分子抑制劑集中在清熱類藥材中，其中含有最多潛在IL-6R天然小分子抑制劑的為甘草，可為IL-6R天然小分子抑制劑的開發(fā)提供候選化合物和理論依據(jù)。

芝麻素[20]和木犀草素[21]具有顯著的抗炎藥效，其主要作用機(jī)制是通過顯著降低環(huán)氧合酶2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等活性，誘導(dǎo)產(chǎn)生炎性介質(zhì)的限速酶的表達(dá)及IL-6，TNF-α等促炎因子的產(chǎn)生。芝麻素[22]和木犀草素[23]還有平衡氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的作用，其主要通過抑制活性氧（ROS）的產(chǎn)生和提高過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷。此外，芝麻素[24]和木犀草素[25]還有顯著的抗高血壓、高血脂、高血糖（簡稱三高）作用及血管內(nèi)皮保護(hù)功能，表明芝麻素和木犀草素具有潛在的保護(hù)心血管系統(tǒng)功能。近期研究表明，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、糖尿病患者是COVID-19的易感人群[26]，且三高疾病會(huì)加重COVID-19患者的病情。因此，面對(duì)并發(fā)心血管疾病的COVID-19患者，對(duì)其進(jìn)行抗病毒、抗炎、增強(qiáng)免疫治療的同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)防范誘發(fā)或加重COVID-19患者病情的危險(xiǎn)因素。

此外，本研究中從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度進(jìn)一步探討了甘草抗COVID-19可能參與的生物過程與信號(hào)通路。KEGG通路富集和GO生物功能注釋分析結(jié)果表明，甘草參與治療COVID-19的16個(gè)潛在作用靶點(diǎn)主要富集在HIF-1，VEGF，Platelet activation，TNF，PI3K-Akt，IL-17，TLR等與肺癌、肺纖維化、肺炎、氣道炎癥、肺栓塞等肺部疾病密切相關(guān)的信號(hào)通路中，上述通路主要涉及免疫調(diào)節(jié)、炎性干預(yù)、氧化應(yīng)激、抗凝與凝血系統(tǒng)調(diào)控等生物功能，提示甘草通過多通路協(xié)同發(fā)揮治療COVID-19的作用。

甘草具有潤肺止咳、補(bǔ)氣益腎、調(diào)和解毒、緩急止痛等功效，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理學(xué)作用，國內(nèi)外一直用甘草及其提取物治療咳嗽、支氣管炎、肺炎等呼吸系統(tǒng)疾病，主要通過抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，改善免疫功能而抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)、減輕肺纖維化形成和急性肺損傷等，以保護(hù)肺上皮細(xì)胞，改善肺功能，保護(hù)宿主；其物質(zhì)基礎(chǔ)主要包括多糖類、黃酮類、三萜類等，尤其是甘草酸苷、甘草素、異甘草素、甘草酸二銨及甘草酸、甘草查爾酮A、光甘草定等成分[27]。有研究證實(shí)，甘草酸作為甘草中含量最高的有效成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與激素類似，具有類皮質(zhì)激素作用，主要用于對(duì)抗病毒炎性風(fēng)暴，兩者同為抗炎藥，最大的區(qū)別在于甘草酸無免疫抑制作用[28]。因此，甘草酸在抗炎的安全劑量范圍內(nèi)既可抵抗炎性風(fēng)暴，又不干擾機(jī)體對(duì)抗病毒的能力。復(fù)方甘草酸苷用于治療非典型肺炎的臨床效果確切，其主要成分甘草酸苷為甘草中的有效活性成分[29]，具有保護(hù)肝細(xì)胞膜、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫等藥理學(xué)作用，鑒于SARS-CoV-2與SARS-CoV有很多相似之處[30]，因此，考慮甘草酸苷用于治療SARS-CoV-2具有很大的借鑒意義。作為甘草主要活性成分之一的甘草酸二胺能明顯抑制普通型COVID-19患者的炎性反應(yīng)，提高免疫功能[31]，且臨床療效顯著，安全性高。

甘草次酸具有抑制血小板聚集的作用，可能是通過抑制血小板活化因子生物合成的通路，除了通過抑制COX-2蛋白和mRNA表達(dá)外，還能抑制磷脂酶A2活性、血栓素A2合成、磷酸二酯酶升高，降低環(huán)磷酸腺苷水平等多個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)抑制血小板聚集作用，阻斷血栓形成，進(jìn)而防治肺栓塞的發(fā)生、發(fā)展[32]。異甘草素和甘草酸作為甘草的主要活性成分[33]，是一種凝血酶抑制劑，能延長血漿復(fù)鈣、凝血酶和纖維蛋白原凝塊時(shí)間，抑制凝血酶誘導(dǎo)血小板聚集，抑制血栓形成，上述過程主要受VEGF信號(hào)通路和Platelet activation通路調(diào)控。甘草及其有效成分具有降糖、調(diào)脂作用，可從源頭上防治糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展[34]。糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）為調(diào)控糖尿病、糖尿病并發(fā)癥的重要信號(hào)通路[35]，甘草酸及其苷元甘草次酸可通過AGE-RAGE信號(hào)通路防治糖尿病腎病和糖尿病血管病變[36]。甘草單一成分的多靶點(diǎn)藥效和機(jī)制研究提示上述成分對(duì)甘草抗COVID-19藥效具有重要貢獻(xiàn)。

甘草有效成分對(duì)心、腦、血管、肝、腎、肺等各種臟器具有保護(hù)作用[37]，有助于防治糖尿病引起的各種并發(fā)癥，提示甘草有利于阻斷COVID-19炎性風(fēng)暴對(duì)患者多器官的損傷。因此，甘草可在減輕炎癥對(duì)機(jī)體急性損傷的同時(shí)，面對(duì)危重患者的高凝狀態(tài)還有防治肺栓塞的潛在藥效，提示甘草不僅具有潛在的抗COVID-19炎性風(fēng)暴作用，還能有效防治并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，這可能與甘草配伍其他中藥治療COVID-19患者起到協(xié)同增效、調(diào)和諸藥作用有關(guān)。目前，未見甘草及其主要活性成分抗COVID-19的潛在機(jī)制HIF-1，PI3K-Akt信號(hào)通路的相關(guān)報(bào)道，但可為甘草及其主要活性成分抗COVID-19的作用機(jī)制研究提供新的研究方向和思路，以及為抗COVID-19的新藥開發(fā)提供候選化合物及甘草抗COVID-19的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的闡釋提供一定理論依據(jù)。

我國自主研發(fā)的“三方三藥”[38]在此次抗疫中起到了非常重要的作用，“三方三藥”中的“清肺排毒湯”“化濕敗毒方”“宣肺敗毒方”，以及連花清瘟顆粒/膠囊、血必凈注射液、金花清感顆粒6個(gè)中藥組方均含有甘草。從清肺排毒湯中共鑒定出了39種化學(xué)成分[39]，且檢測(cè)到其入血成分共12種，這些成分廣泛分布于血清、心、肝、脾、肺、腎中，包括甘草的甘草酸、甘草苷等主要成分；連花清瘟中鑒定出61種化學(xué)成分，且22種以原型入血，包括甘草的主要成分芹糖甘草苷、芹糖異甘草苷、異甘草苷、甘草苷、甘草素、甘草酸等[40]。對(duì)全國抗COVID-19方劑的組方規(guī)律的分析結(jié)果表明，甘草的使用頻次最高[41]。本研究結(jié)果與以上研究不謀而合，可為抗COVID-19方劑配伍甘草的原因提供更多參考。

本研究中以分子對(duì)接技術(shù)高通量虛擬篩選獲得了最具代表性的潛在抗IL-6R的天然小分子抑制劑如芝麻素和木犀草素等化合物，以及包含該類天然小分子抑制劑最多的中藥甘草。芝麻素和木犀草素除了具有抗IL-6R的潛在活性外，還具有抗炎、抗氧化、降血壓、調(diào)脂、降血糖等多種藥理作用，具備應(yīng)對(duì)COVID-19復(fù)雜發(fā)生、發(fā)展的潛在能力。作為“國老”的甘草，不僅其多種化學(xué)成分具有潛在的抗IL-6R活性，其多種主要活性成分還具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗血栓、調(diào)脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力等廣泛的藥理學(xué)作用，且對(duì)多種器官具有保護(hù)作用。甘草通過多種途徑抵抗COVID-19對(duì)患者器官損傷的同時(shí)，還能防治重癥患者并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展，充分體現(xiàn)了中藥“多成分-多靶點(diǎn)”作用機(jī)制的復(fù)雜性及其藥理學(xué)作用的多效性和廣泛性，說明了抗COVID-19方劑中配伍甘草入藥的原因。本研究中僅采用虛擬對(duì)接技術(shù)分析，具有一定局限性，還需進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。