中藥復(fù)方止癬乳膏的提取及制備工藝優(yōu)選*

趙 瑩，翟 明，李苑華，張聲源，江中洪

（1.嘉應(yīng)學(xué)院，廣東 梅州 514031； 2.廣東省山區(qū)特色農(nóng)業(yè)資源保護(hù)與精準(zhǔn)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 梅州514031； 3.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣東 梅州 514031）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，手足癬由外感濕熱、毒蟲(chóng)沾染引起，日久郁阻皮膚脈絡(luò)，造成血不榮膚，治療多選用殺蟲(chóng)、祛濕、清熱、祛風(fēng)、活血之劑[1]。本課題組的前期研究中結(jié)合中醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ)，選用具有殺蟲(chóng)、祛濕、清熱、祛風(fēng)、活血等功效的皂角、荊芥、紅花及白礬4味中藥組方[2-4]，篩選其對(duì)具有抗真菌和抗炎作用的有效成分[5-6]，以槲皮素和總黃酮為指標(biāo)成分，優(yōu)化提取方法。目前，市場(chǎng)上的抗足癬軟膏多為化學(xué)抗菌藥物[7-8]，抗足癬類(lèi)中藥仍以洗劑為主[9-10]，而洗劑不易攜帶，藥液難以附著于皮膚，起效較慢。本研究中在對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化后，擬開(kāi)發(fā)一種復(fù)方中藥抗足癬軟膏，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化其制備工藝，并考察制劑的穩(wěn)定性，為復(fù)方中藥止癬乳膏的開(kāi)發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）；MING-CHE 24UV型超純水機(jī)（法國(guó)Merck Millipore公司）；TDZ5-WS型臺(tái)式離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司）；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海鴻都電子科技有限公司）；BSA1245型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為萬(wàn)分之一）；JP-060型超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟設(shè)備有限公司，功率為240W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

槲皮素對(duì)照品（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究所，批號(hào)為C15H1007，純度≥98%）；蘆丁對(duì)照品（奧科生物科技研究所，批號(hào)為BWB51607，純度≥98%）；其他試劑均為分析純；皂角藥材（批號(hào)為20180115），荊芥藥材（批號(hào)為20180926），均購(gòu)于宿遷圣軒閣有限公司；紅花藥材（批號(hào)為20180709），白礬藥材（批號(hào)為20170813），均購(gòu)于大參林藥業(yè)股份有限公司。上述中藥材均經(jīng)嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院張聲源中藥學(xué)副教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝研究

2.1.1 復(fù)方中藥處方

取皂角、荊芥、紅花、白礬藥材各3 g，按1∶15（m/V）料液比進(jìn)行配制。

2.1.2 提取方法考察[11-12]

水提法：1）水煎煮法。按1∶15（m/V）料液比加水，提取2次，合并提取液，濾紙過(guò)濾，密封備用。2）水超聲法。按1∶15（m/V）料液比加水，超聲提?。üβ蕿?40 W，溫度為50℃）1.5 h，提取液用濾紙過(guò)濾，密封，備用。

酸提法：1）酸浸提法。冰乙酸浸漬提取24 h，提取液用濾紙過(guò)濾，密封，備用。2）酸超聲法。提取條件與水超聲法相同，提取溶劑換為冰乙酸。

醇提法：醇浸提法與醇超聲法的反應(yīng)條件分別同酸浸提法和酸超聲法一致，提取溶劑更換為70%乙醇。

2.1.3 總黃酮提取率考察

蘆丁對(duì)照品溶液制備：稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品9.4 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL燒杯中，以60%乙醇溶液溶解，吸取0.5 mL，置50 mL容量瓶中，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.188 mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

蘆丁線性關(guān)系考察：分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.50，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL，置10 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min；加4%NaOH溶液4 mL，再用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，顯色[13]，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。得回歸方程Y=0.220 8 X+0.006 8，R2=0.999 5（n=6），表明蘆丁質(zhì)量濃度在0.5～5.0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

總黃酮提取率測(cè)定：按2.1.2項(xiàng)下提取工藝進(jìn)行提取，過(guò)濾，取提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得供試品溶液。精密吸取供試品提取液1 mL，置100 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度[13]。按公式1）計(jì)算總黃酮提取率（X）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同提取方法的總黃酮提取率比較Fig.1 Comparison of extraction rates of total flavonoid by different extraction methods

式中，X為總黃酮或槲皮素的提取率（%）；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的總黃酮或槲皮素質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為藥材提取液總體積（mL）；P為稀釋倍數(shù)；W為藥材質(zhì)量（mg）。

由圖1可知，超聲醇提法的總黃酮提取率最高為60.16%。水提取和醇提取過(guò)程中，超聲法的提取率高于煎煮法或浸漬法；酸提取過(guò)程中，浸提法高于超聲法。

2.1.4 槲皮素提取率考察

槲皮素對(duì)照品溶液制備：取槲皮素對(duì)照品1.5 mg，精密稱(chēng)定，于燒杯中溶解，潤(rùn)洗2～3次，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為15μg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

槲皮素線性關(guān)系考察：分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 mL，置25 mL容量瓶中，以蒸餾水為空白參比，于382 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸 光 度。得 回 歸 方 程Y=0.341 9X-0.002 1，R2=0.9992（n=8），表明槲皮素質(zhì)量濃度在0.1～0.6 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

槲皮素提取率測(cè)定：按2.1.2項(xiàng)下提取工藝進(jìn)行提取，過(guò)濾，取提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得供試品溶液。精密吸取總黃酮提取率測(cè)定項(xiàng)下供試品提取液1 mL，置50 mL容量瓶中，按公式1）計(jì)算槲皮素提取率（X）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同提取方法的槲皮素提取率比較Fig.2 Comparison of extraction rates of quercetin by different extraction methods

由圖2可知，以水和醇作為提取溶劑時(shí)槲皮素的提取率高于以酸為提取溶劑，且超聲法高于煎煮法或浸提法。分析原因，相較于浸提法及煎煮法，超聲法的溫度和超聲微波作用可提高提取率，從而增加槲皮素在提取溶劑中的溶解度，則槲皮素的浸出量相對(duì)較多。結(jié)合總黃酮提取率，則槲皮素的提取率為0.07%。

2.1.5 最佳提取工藝確定

綜合總黃酮和槲皮素的提取率考察結(jié)果，最終確定該復(fù)方最佳提取工藝為70%乙醇超聲提取，功率為240 W，溫度為50℃，提取1.5 h。

2.2 槲皮素與總黃酮含量測(cè)定方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密吸取槲皮素、總黃酮對(duì)照品溶液各0.2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6次。結(jié)果槲皮素、總黃酮吸光度的RSD分別為0.21%和1.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取復(fù)方中藥材粉末，各3 g，精密稱(chēng)定，按上述最佳提取工藝提取，共制備供試品溶液12份，按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。結(jié)果槲皮素、總黃酮吸光度的RSD分別為0.26%和1.75%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取復(fù)方中藥材粉末，各3 g，精密稱(chēng)定，按上述最佳提取工藝提取，過(guò)濾提取液，精密吸取提取液0.2 mL，于室溫下放置0，1，3，5，7，9，12，24 h時(shí)按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度。結(jié)果槲皮素、總黃酮吸光度的RSD分別為0.33%和1.52%（n=8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.3 制備工藝研究

2.3.1 處方及制備

乳膏處方見(jiàn)表1。制備步驟為，按處方量稱(chēng)取A，C兩相中各原料作為水相，稱(chēng)取處方量B相中各原料作為油相，置（80±2）℃恒溫水浴箱中，攪拌，混勻，待油、水兩相完全溶解后，用溫度計(jì)測(cè)量溫度至（80±2）℃后，把油相（B相）倒入水相（A，C相）中，用玻璃棒在水浴鍋中往同一方向緩慢攪拌15 min，移出，室溫下繼續(xù)攪拌至冷凝。

表1 復(fù)方中藥乳膏基質(zhì)組分Tab.1 Matrix components of TCM compound cream

2.3.2 乳膏評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

總分100分，其中外觀質(zhì)量、pH、離心穩(wěn)定性及耐熱、耐寒穩(wěn)定性各20分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 乳膏評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Scoring criteria of cream

2.3.3 制備工藝優(yōu)選

以十二烷基硫酸鈉（因素A）和單硬脂酸甘油酯（因素B）的含量、乳化溫度（因素C）、乳化時(shí)間（因素D）為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)因素水平表（見(jiàn)表3）。以綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)制備工藝（見(jiàn)表4），并采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Tab.3 The factor levels of the orthogonal test

由表4可知，各因素對(duì)結(jié)果影響大小的順序?yàn)镈＞C＞A＞B，且最優(yōu)處方為A3B2C2D1，即十二烷基硫酸鈉含量為1.5%，單硬脂酸甘油酯含量為4.0%，乳化溫度為80℃，乳化時(shí)間為15 min。由表5可知，各因素對(duì)結(jié)果均有顯著影響。故最終確定此條件為最優(yōu)制備工藝。

表4 L 9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.4 Design scheme and results of the L 9（34）orthogonal test

表5 L 9（34）正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.5 ANOVA results of the L 9（34）orthogonal test

3 討論

本研究中選取皂角中具有抑菌作用的主要成分槲皮素，以及4味中藥中均含有的抗炎成分總黃酮[14-17]的提取率作為考察指標(biāo)，建立其紫外分光光度測(cè)定方法，篩選提取條件。

分別選擇了煎煮、浸漬、超聲、加熱回流4種提取方法[18]，經(jīng)過(guò)含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，加熱回流提取法的提取液中槲皮素和總黃酮的響應(yīng)值均較低，原因可能為加熱回流提取過(guò)程中藥材的結(jié)構(gòu)被破壞，有效成分含量降低，故最終選擇煎煮、浸漬和超聲3種提取方法進(jìn)行研究。由圖1和圖2可知，超聲水提法和超聲醇提法的總黃酮和槲皮素提取率均較高，其中超聲醇提法總黃酮提取率最高，可能是由于超聲的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速?gòu)?fù)方中藥材胞內(nèi)有效物質(zhì)釋放、擴(kuò)散和溶解，提高了復(fù)方中藥的提取率。樣品中總黃酮含量遠(yuǎn)高于槲皮素含量，故最終確定最優(yōu)提取工藝為超聲醇提法。

溫度對(duì)油、水兩相的融合、乳化有重要影響。溫度過(guò)低導(dǎo)致乳化不完全；溫度過(guò)高導(dǎo)致水分散失，使乳膏基質(zhì)失水變稠。乳膏制備工藝的單因素考察結(jié)果顯示，70℃和90℃溫度下乳膏的基質(zhì)得分較低。70℃時(shí)離心試驗(yàn)和耐熱試驗(yàn)均出現(xiàn)油水分離現(xiàn)象，原因可能為溫度較低時(shí)油、水兩相乳化不充分；90℃時(shí)，水分揮發(fā)過(guò)快，乳膏基質(zhì)變稠、質(zhì)地變硬、有顆粒感。故選擇75，80，85℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。且乳化時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致油、水兩相乳化不完全，造成基質(zhì)穩(wěn)定性差，耐熱、離心試驗(yàn)均會(huì)出現(xiàn)油、水分離現(xiàn)象。故選擇15，20，25 min乳化時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

制備工藝優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，以十二烷基硫酸鈉為乳化劑，制得的水包油（O/W）型乳膏易于涂抹、清洗，使用方便?；|(zhì)篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，在該處方中，不需將白凡士林與羊毛脂合用，單用白凡士林已有較好的吸水性，且制得的乳膏顏色潔白，耐寒、耐熱，pH穩(wěn)定在6.9～7.0，質(zhì)地、均勻度、涂展性均良好，皮膚潤(rùn)滑度適中，不油膩，易清洗，久置不易變質(zhì)。藥物的加入方式考察中，對(duì)比了主藥提取液的2種不同加入方法。一是將主藥提取液與水相混合，提取液作為水相中的一部分，水浴加熱后與油相在相同溫度下混合；二是先將水相與油相在水浴中混合均勻，再加入主藥提取液。2種方法所制得乳膏的外觀、穩(wěn)定性及載藥量差異均不大，表明藥物的加入方式不是制備中藥復(fù)方止癬乳膏的主要影響因素。