正交試驗結(jié)合特征圖譜法優(yōu)選蛇蟻噴霧劑滲漉工藝*

葉炳皇，張 軍

（1.廣東省中山市黃圃人民醫(yī)院，廣東 中山 528429； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006）

我院臨床經(jīng)方“蟻蛇方”是借鑒孫思邈《千金方》中治療痹癥的經(jīng)典藥酒方劑，通過加減藥味形成的獨特配方，以祛風(fēng)散寒、通絡(luò)止痛為治則，主治風(fēng)寒濕三氣雜至所致各種痹證，以酒劑形式長期應(yīng)用于臨床，療效確切，安全可靠。但由于“蟻蛇方”藥酒浸泡、攜帶、使用不方便的缺陷，本研究中按《醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊管理辦法》項下醫(yī)療機構(gòu)制劑注冊申報資料要求第二項第五條規(guī)定，“根據(jù)中醫(yī)藥理論組方，利用傳統(tǒng)工藝配制”，即制劑配制過程未使原組方中治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生變化，在遵循“蟻蛇方”藥酒制備工藝路線的基礎(chǔ)上，采用乙醇溶劑進行滲漉提取，并采用正交試驗法，以芍藥苷、丹酚酸B和延胡索乙素的綜合保留率為評價指標。目前，特征圖譜或指紋圖譜已普遍用于提取工藝優(yōu)化[1-7]，特征強，信息量大，整體性強，能更全面地評價藥品質(zhì)量。在產(chǎn)業(yè)模式下成方制劑存在長時間濃縮過程，與傳統(tǒng)藥酒相比，特征圖譜、指標成分量可能存在差異[8]。本研究中結(jié)合特征圖譜法對“蟻蛇方”的滲漉工藝進行評價，進一步驗證優(yōu)選的蛇蟻噴霧劑的滲漉工藝參數(shù)，為提高基于臨床傳統(tǒng)工藝配制制劑而研制的成藥制劑的質(zhì)量與臨床療效提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW220D型電子天平（日本島津公司，精度為萬分之一）；Water e2695型高效液相色譜儀（美國沃特世科技公司），配有2998檢測器。

1.2 試藥

延胡索乙素對照品（批號為110726-201515），芍藥苷對照品（批號為110736-201539），丹酚酸B對照品（批號為111562-201514），純度均為99.99%，均購于中國食品藥品檢定研究院；黑螞蟻（批號為150124，廣東盞玉制藥有限公司）；丹參（批號為151201-1），紅花（批號為160301-1），黃藤（批號為160301），辣椒（批號為160702），木瓜（批號為150501），牛大力（批號為160401），桑寄生（批號為151201-1），烏梢蛇（批號為160402），均購于廣西容縣億生中藥飲片廠；當歸（批號為160301），丁香（批號為150601），均購于廣州市集芝寶中藥有限公司；赤芍（批號為160301），醋延胡索（批號為160501），獨活（批號為151201-1），羌活（批號為160402），均購于廣西京聯(lián)中藥飲片有限責任公司；威靈仙（批號為150501，貴港市百草坊中藥飲片有限公司）；乙醇（批號為20170901，廣東省廣寧縣順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司）；甲醇（色譜純，Merck公司）；水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 芍藥苷、丹酚酸B、延胡索乙素含量測定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫（0～20 min時30%A～37%A，20～25 min時37%A～45%A，25～35 min時45%A，35～40 min時45%A～60%A，40～45 min時60%A～30%A，45～55 min時30%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下，供試品溶液色譜圖中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上有相同保留時間的色譜峰，陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.2 溶液制備

取芍藥苷對照品10.08 mg、丹酚酸B 19.87 mg，精密稱定，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容，搖勻，作為芍藥苷對照品貯備液、丹酚酸B對照品貯備液。取延胡索乙素對照品16.38 mg，精密稱定，置200 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容，搖勻，作為延胡索乙素對照品貯備液。分別精密量取芍藥苷對照品貯備液、丹酚酸B對照品貯備液、延胡索乙素對照品貯備液各5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并定容，搖勻，制得芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為1.987，1.008，0.819 mg/mL的混合對照品溶液。按處方比例稱取全方藥材，粉碎，過2號篩，加2倍量70%乙醇使?jié)櫇瘢b柱，浸漬24h，加8倍量70%乙醇，以3mL/（min·kg）的速率滲漉，收集滲漉液，加70%乙醇稀釋至1 000 mL，即得供試品原液。精密量取上述溶液5 mL，置10 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例分別稱取缺赤芍、延胡索、丹參的全方藥材，分別按供試品溶液制備方法制備陰性對照藥材溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.1.2項下混合對照品溶液2，4，8，10，12，16，20μL，注入色譜儀，按2.1.1項下色譜條件測定，以峰面積積分值（Y）為縱坐標、對照品進樣量（X，μg）為橫坐標繪制標準曲線，得芍藥苷、丹酚酸B、延胡索乙素回歸方程，分別為Y芍=1 028 157.067 4X芍+4800.3239（r=0.9996，n=7），Y丹=1095713.6469X丹+4075.1831（r=0.9999，n=7），Y延=1584988.5640X延-2.436 6（r=1.000 0，n=7）。結(jié)果表明，芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B進樣量分別在0.201 6～2.016 0μg、0.016 4～0.163 8μg、0.397 4～3.974 0μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一混合對照品溶液10μL，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次。結(jié)果芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B平均峰面積的RSD分別為0.20%，0.33%，0.22%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24 h時按2.1.1項下色譜條件進樣測定峰面積積分值。結(jié)果芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B平均峰面積的RSD分別為1.87%，1.99%，1.23%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取2.1.2項下混合對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別進樣10μL，重復(fù)操作6次。結(jié)果芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B含量的RSD分別為0.52%，0.43%，0.20%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的同一供試品溶液5.0 mL，共9份，置10 mL容量瓶中，分別精密加入2.1.2項下芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B質(zhì)量濃度分別為1.987，1.008，0.819 mg/mL的混合對照品溶液0.5，1.0，1.5 mL，按2.1.1項下色譜條件進樣10μL，測定峰面積，計算回收率。結(jié)果芍藥苷、延胡索乙素、丹酚酸B的平均回收率分別為100.16%，100.34%，100.15%，RSD分別為0.75%，1.97%，0.38%（n=9）。表明方法回收率良好，符合定量分析要求。

2.2 工藝優(yōu)選

優(yōu)選滲漉工藝條件：臨床采用酒浸漬的傳統(tǒng)配制工藝，故本研究中選取乙醇滲漉工藝。基于中藥滲漉工藝的關(guān)鍵因素分別為粉末粒度、溶劑組成、滲漉流速、溶劑用量[9]及預(yù)試驗結(jié)果。按處方比例稱取全方藥材96 g，含丹參8 g，赤芍6 g，延胡索10 g，考察乙醇體積分數(shù)（因素A）、溶劑用量（因素B）、粉碎粒度（因素C）、滲漉流速（因素D）對指標成分保留率的影響。因素水平見表1。按L9（34）正交試驗進行設(shè)計（見表2），其中加2倍量相應(yīng)濃度的溶劑，潤濕藥粉，浸漬24 h進行滲漉。按供試品溶液制備方法制備，測定并計算指標成分芍藥苷、延胡索乙素及丹酚酸B的綜合保留率。保留率（%）=提取液中指標成分的含量/藥材中指標成分的含量×100%；綜合保留率（%）=芍藥苷保留率×0.25+延胡索乙素保留率×0.42+丹酚酸B保留率×0.33。L9（34）正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 The factor levels of the L 9（34）orthogonal test

表2 L 9（34）正交試驗結(jié)果Tab.2 Results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA

試驗結(jié)果分析：由表2可見，各因素對綜合保留率影響的順序由大至小依次為A＞B＞D＞C，即乙醇體積分數(shù)對綜合保留率影響最大，70%乙醇滲漉效果最佳；溶劑用量對綜合保留率影響次之，12倍量70%乙醇滲漉效果最佳；粉碎粒度對綜合保留率影響不大，粗粉滲漉效果較佳；滲漉流速對綜合保留率影響最小，滲漉流速為9 mL/（min·kg）時滲漉效果較佳，且有利于縮短生產(chǎn)時間，降低時間成本。滲漉工藝的最佳工藝為A3B3C2D3，即處方藥材粉碎成粗粉，加2倍量70%乙醇使?jié)櫇瘢n24 h，用10倍量70%乙醇以9 mL/（min·kg）的速率進行滲漉。

工藝驗證試驗：按最佳滲漉工藝條件A3B3C2D3進行重復(fù)試驗，3批驗證結(jié)果中，芍藥苷平均保留率為88%，延胡索乙素平均保留率為90%，丹酚酸B平均保留率為91%，與正交滲漉結(jié)果一致，表明該工藝合理、穩(wěn)定可行。

2.3 特征圖譜比較

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004A版）軟件，將正交滲漉工藝和傳統(tǒng)工藝的供試品溶液高效液相色譜特征圖譜進行疊加，并對相似度進行分析。結(jié)果見圖2和表4。

表4 不同工藝相似度分析結(jié)果Tab.4 The similarities of different processes

圖2 正交滲漉工藝和傳統(tǒng)工藝供試品溶液高效液相色譜特征圖譜疊加圖Fig.2 Superposed HPLC specific chromatogram of test solution with orthogonal percolation process and traditional process

由圖2可知，9個正交滲漉工藝與傳統(tǒng)工藝供試品共標定了12個共有峰，各特征峰出峰時間無差異，僅為量的差異，S9最大，S1最小，提示不同提取工藝對有效成分提取量大小有顯著影響。相似度分析結(jié)果表明，以S10為對照特征圖譜，S1-S9相似度均大于0.90，提示本組方乙醇滲漉工藝與傳統(tǒng)藥酒浸泡工藝的有效物質(zhì)基礎(chǔ)無本質(zhì)區(qū)別，正交試驗優(yōu)化所得工藝參數(shù)基本遵循臨床用藥經(jīng)驗，制劑配制過程沒有使原組方中治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生變化。可見，所優(yōu)選的工藝穩(wěn)定、合理，可為蛇蟻噴霧劑的規(guī)模化生產(chǎn)提供參考。

3 討論

3.1 指標性成分及綜合評分選擇

基于本組方為中藥復(fù)方制劑，采用單一指標不能完整、真實地反映全方的有效成分。臣藥赤芍、丹參、延胡索的主要成分均易溶于乙醇，2015年版《中國藥典（一部）》收載成方制劑多采用乙醇提取[10]，故采用乙醇進行提取。芍藥苷具有鎮(zhèn)痛作用[11]，丹參活血化瘀功效的潛在標志物為丹酚酸B[12]，延胡索乙素是延胡索鎮(zhèn)痛作用最強的成分[13-14]，故選擇芍藥苷、延胡索乙素和丹酚酸B綜合保留率為考察指標。根據(jù)臣藥赤芍、丹參、延胡索方中組成比例為6∶8∶10（m/m/m），故設(shè)定綜合保留率的權(quán)重系數(shù)分別為0.25，0.33，0.42。

3.2 與傳統(tǒng)工藝比較評價

“蟻蛇方”藥酒的制備工藝為“粉碎，浸泡10 d以上，濾過，即得”。基于遵循“蟻蛇方”藥酒的制備工藝，本研究中采用乙醇溶劑滲漉提取，優(yōu)選蛇蟻噴霧劑的滲漉工藝參數(shù)，但考慮到工藝參數(shù)的差異可能導(dǎo)致化學(xué)成分變化，對原方臨床療效產(chǎn)生影響[8]。還采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)對不同提取工藝特征圖譜進行分析，以傳統(tǒng)工藝為參考圖譜，時間窗寬度設(shè)為0.1 min，采用多點校正后自動匹配S1-S9及S10的指紋圖譜，建立高效液相色譜特征圖譜的共有模式，并計算特征圖譜中12個特征峰的相對峰面積及相似度。結(jié)果表明，不同工藝所得樣品與臨床傳統(tǒng)工藝所得藥酒在已有化學(xué)成分共有模式下無本質(zhì)區(qū)別。另外，后續(xù)研究還需比較藥效學(xué)參數(shù)，進一步驗證所優(yōu)化工藝的臨床療效[15-16]。

3.3 色譜條件選擇

采用二極管陣列檢測器，于200～400 nm波長范圍進行掃描，結(jié)果于230 nm和316 nm波長處色譜峰多，且主要色譜峰具有較高的響應(yīng)值及峰形，基線干擾小。當檢測波長為230 nm時，基線穩(wěn)定，各共有峰在同一波長下均有較好吸收，干擾最少，結(jié)合主要色譜峰的3D圖譜，檢測波長最終選用230 nm。另外，比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等多個流動相系統(tǒng)。結(jié)果顯示，采用乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液時，所得峰形均對稱，理論板數(shù)均高，且分離度良好。出于有機試劑毒性與勞動保護的考慮，選擇毒性相對較低的甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相。