紫蘇葉化學成分研究及抗炎活性初步評價

王宇寧，樊 暉，梁克利，3

（1.遼寧省沈陽市第七人民醫院，遼寧 沈陽 110000； 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110847；3.哈爾濱商業大學，黑龍江 哈爾濱 150076）

紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.為唇形科紫蘇屬1年生草本植物，又名白蘇、名蘇、赤蘇、桂荏等，藥用及食用歷史悠久，是公認的藥食同源植物。紫蘇在亞洲南至印度尼西亞，東至日本、朝鮮均有分布[1]。我國廣泛栽培，2015年版《中國藥典》規定其葉、子、梗均為藥用部位。中醫學理論認為，紫蘇具有解表散寒、宣肺化痰、行氣和胃等功效，臨床主要用于急性胃炎、腸炎、腎炎、慢性支氣管炎等炎性疾病的治療[2-7]。紫蘇葉中的黃酮類、酚酸類、萜類、揮發油類成分為紫蘇葉的主要化學成分[8-11]，但其抗炎活性成分的報道較少。本研究中系統分離了紫蘇葉的化學成分，以RAW264.7細胞為評價模型，評價了各化合物對誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及環氧合酶2（COX-2）蛋白表達水平的影響。現報道如下。

1 儀器、試藥與細胞

1.1 儀器

Bruker-400型核磁共振（NMR）儀（四甲基硅烷內標，德國Bruker公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司），配有紫外檢測器；JY-SCZ2型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；4600型全自動化學發光成像分析儀（上海天能科技有限公司）；正向硅膠色譜柱（中國青島海洋化工廠）；D101大孔吸附樹脂（滄州寶恩樹脂科技有限公司）；反相ODS硅膠色譜柱（美國Welch公司）。

1.2 試藥

二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司，批號為180412）；Peroxidase-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit（批 號 為P181123），Anti-β-actin（批 號 為sc 69879），均 購 自 美 國Proteintech Group Inc.；P-Tau Rabbit mAb（Cell Signaling，批號為15013）；Tau Rabbit mAb（Abcam公司，批號為46687）；MarKer（Rainbow公司，批號為20190302）；細胞裂解液（批號為20190425），PMSF（批號為20190327），電化學發光（ECL）法發光液（批號為20190402），均購自上海碧云天生物技術有限公司；四甲基乙二胺（TEMED，批號為191037），聚偏氟乙烯膜（PVDF膜，批號為192113），均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；甲醇等有機試劑均購自天津大茂化學試劑有限公司；紫蘇葉購自遼河大藥房，批號為20170335，經哈爾濱商業大學吳健博士鑒定為紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉。

1.3 細胞

RAW264.7細胞株（ATCC，批號為20160812）。

2 方法與結果

2.1 提取與分離

取干燥紫蘇葉15 kg，以8倍量75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取物，減壓濃縮至無醇味，得提取物浸膏2.3 kg。浸膏以蒸餾水溶解，用D101大孔吸附樹脂分離，以乙醇-水溶液（0→100%）梯度洗脫，30%洗脫部分經硅膠柱、十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）柱進一步分離，采用高效液相色譜（HPLC）法純化得到化 合 物1（23.5 mg）、化 合 物2（17.6 mg）、化 合 物3（21.2 mg）、化合物4（17.3 mg）；60%洗脫部分經硅膠柱、C18ODS柱進一步分離，采用HPLC法純化，得到化合物5（13.8 mg）、化合物6（26.1 mg）。

2.2 化合物鑒定

化合物1：淡黃色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：6.97（1H，d，J=15.8 Hz，H-7），6.27（1H，d，J=15.8 Hz，H-8），5.86（1H，brs，H-4），2.64（1H，d，J=16.9 Hz，H-2），2.17（1H，m，H-2），2.26（3H，s，H-10），1.80（3H，s，H-11），0.96（3H，s，H-12），0.92（3H，s，H-13）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：41.2（C-1），49.3（C-2），198.3（C-3），126.6（C-4），161.8（C-5），78.1（C-6），147.2（C-7），130.5（C-8），198.5（C -9），27.2（C-10），18.6（C-11），23.2（C-12），24.2（C-13）。以上波譜數據與文獻[12]報道結果基本一致，經鑒定，化合物1為4-hydroxy-4，5-trimethyl-3-（3-oxobut-1-enyl）cyclohex-2-enone（C13H18O3）。

化合物2：淡黃色粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：5.79（1H，brs，H-8），4.10（1H，m，H-3），2.31（1H，dd，J=13.3，2.5 Hz，H-2），1.88（1H，dd，J=14.1，2.5 Hz，H-4），1.68（3H，s，H-12），1.64（1H，dd，J=13.3，3.6 Hz，H-2），1.43（1H，dd，J=14.1，3.6 Hz，H-4），1.39（3H，s，H-11），1.21（3H，s，H-10）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：35.9（C-1），46.8（C-2），65.1（C-3），45.5（C-4），86.7（C-5），171.3（C-7），112.5（C-8），183.3（C-9），25.4（C-10），30.6（C-11），27.0（C-12）。以上波譜數據與文獻[13]報道結果基本一致，經鑒定，化合物2為loliolide（C11H16O3）。

化合物3：淡黃色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：6.89（1H，d，J=16.1 Hz，H-7），6.31（1H，d，J=16.1 Hz，H-8），2.76（1H，dd，J=13.6，2.1 Hz，H-2），2.37（1H，m，H-4），2.28（3H，s，H-10），2.06（1H，m，H-4），1.77（1H，dd，J=13.3，2.1 Hz，H-2），1.66（1H，m，H-5），0.93（3H，s，H-11），0.88（3H，s，H-12），0.81（3H，d，J=6.1 Hz，H-13）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：42.9（C-1），51.2（C-2），210.2（C-3），44.7（C-4），35.7（C-5），77.1（C-6），150.7（C-7），131.3（C-8），198.0（C-9），27.3（C-10），24.6（C-11），24.6（C-12），16.1（C-13）。以上波譜數據與文獻[14]報道結果基本一致，經鑒定，化合物3為（E）-4-hydroxy-3，3，5-trimethy1-4（3-oxobut-1-en-1-yl）cyclohexan-1-one（C13H20O3）。

化合物4：白色粉末。1H-NMR（400 MHz，DMSOd6）：5.78（2H，s，H-8），4.08（1H，m，H-3），2.29（1H，dd，J=13.3，2.5 Hz，H-2），1.87（1H，m，H-4），1.67（3H，s，H-12），1.62（1H，m，H-2），1.44（1H，m，H-4），1.38（3H，s，H-11），1.18（3H，s，H-10）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：34.7（C-1），47.4（C-2），63.0（C-4），49.7（C-5），86.4（C-8），170.9（C-9），112.3（C-10），181.8（C-11），26.2（C-12）。以上波譜數據與文獻[15]報道結果基本一致，經鑒定，化合物4為isololiolide（C11H16O3）。

化合物5：淡黃色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：7.00（1H，d，J=1.4 Hz，H-2），6.87（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），6.82（1H，s，H-2′），6.72（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.69（1H，d，J=8.0 Hz，H-6′），6.64（1H，d，J=8.2，1.4Hz，H-6），5.30（1H，d，J=4.6 Hz，H-7），4.72（1H，m，H-8），4.58（1H，m，H-9′），4.48（1H，m，H-9′），4.23（2H，m，H-9），3.74（3H，s，3-OCH3），3.71（3H，s，3′-OCH3），2.62（2H，m，H-7′），1.69（2H，m，H-8′）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：133.5（C-1），111.6（C-2），147.2（C-3），145.6（C-4），114.8（C-5），119.7（C-6），71.8（C-7），84.2（C-8），60.3（C-9），133.5（C-1′），113.1（C-2′），149.8（C-3′），146.2（C-4′），116.3（C-5′），120.3（C-6′），31.4（C-7′），34.7（C-8′），60.5（C-9′），55.6（3-OCH3），55.8（3′-OCH3）。以上波譜數據與文獻[16]報道結果基本一致，經鑒定，化 合 物5為erythro-（7 S，8 R）-guaiacyl-glycerolβ-O-4′-dihydroconiferyl ether（C20H26O7）。

化合物6：黃色油狀物。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）：7.09（1H，d，J=8.4，1.7 Hz，H-6′），7.04（1H，d，J=8.4 Hz，H-5′），6.93（1H，d，J=8.2，1.7 Hz，H-6），6.90（1H，d，J=1.7 Hz，H-2），6.79（1H，d，J=1.7 Hz，H-2′），6.67（1H，d，J=8.2 Hz，H-5），4.91（1H，d，J=7.0 Hz，H-1′′），4.80（1H，d，J=5.2 Hz，H-7），4.29（1H，m，H-8），3.76（3H，s，3-OCH3），3.73（3H，s，3′-OCH3），3.65（1H，m，H-6′′），3.57（1H，dd，J=11.8，2.8 Hz，H-9），3.49（1H，dd，J=11.8，3.5 Hz，H-9），3.44（1H，m，H-6′′），3.43（2H，t，J=6.4 Hz，H-9′），3.29（1H，m，H-3′′），3.24（1H，m，H-5′′），3.22（1H，m，H-4′′），3.12（1H，m，H-2′′），2.57（2H，m，H-7′），1.71（2H，m，H-8′）。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）：136.3（C-1），111.9（C-2），148.5（C-3），145.7（C-4），114.7（C-5），116.2（C-6），71.6（C-7），84.0（C-8），60.1（C-9），136.4（C-1′），113.1（C-2′），149.8（C-3′），146.1（C-4′），114.8（C-5′），3′-OCH3，120.3（C-6′），31.5（C-7′），34.7（C-8′），60.4（C-9′），55.7（3-OCH3），55.8（3′-OCH3），100.3（C-1′′），73.5（C-2′′），77.2（C-3′′），69.9（C-4′′），77.1（C-5′′），60.8（C-6′′）。以上波譜數據與文獻[17]報道結果基本一致，經鑒定，化合物6為erythro-（7S，8R）-guaiacyl-glycerol-β-O-4′-dihydroconiferyl ether-7-O-β-D- glucopyranoside（C26H36O12）。

2.3 抗炎活性評價

將RAW264.7細胞株培養于DMEM培養基中[含有10%胎牛血清（FBS）]，細胞按每孔8×104個/0.5 mL接種至24孔板內孵育24 h。使用不同待測化合物（DMSO溶解，終濃度為80μmol/L）及陽性藥地塞米松預處理1 h，用脂多糖（質量濃度為100 ng/mL）刺激18 h，提取細胞總蛋白，采用蛋白免疫印跡（Wester blotting）法檢測iNOS和COX-2蛋白的表達水平。

經質量濃度為100 ng/mL的脂多糖刺激后，iNOS和COX-2蛋白的表達水平均顯著升高，提示細胞炎性模型造模成功。由圖1可見，陽性藥地塞米松可顯著抑制iNOS和COX-2蛋白的表達。化合物1可顯著抑制COX-2蛋白的表達，化合物2，3，4均可顯著抑制iNOS蛋白的表達，提示其均有抗炎活性。

圖1 化合物1-6對RAW264.7細胞中iNOS及COX-2蛋白表達的抑制Fig.1 Inhibitory effect of compounds 1-6 on the expression of iNOS and COX-2 protein in RAW264.7 cells

3 討論

紫蘇葉的75%乙醇-水提取物經大孔吸附樹脂洗脫，正向硅膠柱、反相C18ODS柱及葡聚糖凝膠色譜柱等常規柱色譜方法進行分離，采用半制備型HPLC法對所得成分進行純化，最終得到6個單體化合物，應用NMR技術，并參照文獻，最終明確了這6個單體成分的結 構。分 別 為4-hydroxy-4，5-trimethyl-3-（3-oxobut-1-enyl）cyclohex-2-enone（化 合 物1），loliolide（化合物2），（E）-4-hydroxy-3，3，5-trimethy-1-4（3-oxobut-1-en-1-yl）cyclohexan-1-one（化合物3），isololiolide（化合物4），erythro-（7S，8 R）-guaiacyl-glycerol-β-O-4′- dihydroconiferyl ether（化 合 物5），erythro-（7 S，8 R）-guaiacyl-glycerolβ-O-4′-dihydroconiferyl ether-7-O-β-D-glucopyranoside（化合物6）。

以RAW264.7細胞為評價模型，對分離得到的各單體成分的體外抗炎活性進行初步評價。通過Western blotting法檢測化合物對相關蛋白表達水平的影響，確定化合物的抗炎活性。結果顯示，化合物2，3，4在80μmol/L時可顯著抑制iNOS蛋白的表達，化合物1可抑制COX-2蛋白的表達。本研究明確了紫蘇葉的抗炎活性成分，為后續紫蘇葉的開發和應用奠定了基礎。