鹽酸蘆氟沙星膜劑含量測定及體外透皮效果研究

金偉華，蒲志強，陳 華，于波濤△，余志軍

（1.中國人民解放軍西部戰區總醫院藥劑科，四川 成都 610083；2.西南醫科大學藥學院，四川 瀘州 646000）

鹽酸蘆氟沙星是新型的第3代喹諾酮類抗菌藥物，具有抗菌譜廣、口服吸收好、半衰期長、組織分布廣等藥動學特點，臨床多用于敏感菌引起的泌尿道感染、下呼吸道感染等；同時具有免疫調節作用，可增強吞噬細胞的吞噬功能和吞噬活性[1]。鹽酸蘆氟沙星尚無膜劑，且與同屬氟喹諾酮類藥物的諾氟沙星、左氧氟沙星作用類似，半衰期長，可減少給藥頻次，患者依從性好。目前，諾氟沙星、左氧氟沙星均有眼用制劑。本研究中制備了一種新型的鹽酸蘆氟沙星膜劑，用于局部創傷感染如敏感菌引起的口腔潰瘍及皮膚和婦科感染等。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；PHS-3C型精密pH計（上海康儀儀器有限公司）；豎式改良的Franz擴散池（自制，有效擴散面積為2.5 cm2）；ZB-ZE型智能崩解儀（天津市天大天發科技有限公司）；85-2型恒溫磁力攪拌器（金壇市城東新瑞儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸蘆氟沙星對照品（美國Med Chem Express LLC公司，批號為19143，含量為99.60%）；鹽酸蘆氟沙星膜劑（自制，批號分別為180328，180410，180411，180412，規格為每片2 mg）；0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，批號為K18030409）；聚乙烯醇17-88（PVA17-88，成都市科隆化學品有限公司，批號為2017090801，含量≥98%）；甘油（國藥控股星鯊制藥＜廈門＞有限公司，批號為20870101，含量≥95%）；聚山梨酯-80（Tween-80，江西益普生藥業有限公司，批號為20161002）；乙腈為色譜純，枸櫞酸、無水硫酸鈉均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

雄性昆明種小鼠，體質量20～25 g，購于成都達碩實驗動物公司，生產合格證SCXK（川）2015-030。置小白鼠飼養盆內和20～28℃的空調房間，保證空氣流通，每天早晚喂食1次專用飼料，每天更換1次食用水，每周更換2次墊料，定期對所用器具進行消毒。

2 方法與結果

2.1 鹽酸蘆氟沙星膜劑制備[2]

取PVA17-88 2 g，加入25 mL水中，充分膨脹后置85℃水浴加熱，攪拌至完全溶解，加甘油0.4 mL和Tween-80 0.2 mL，加入鹽酸蘆氟沙星原料藥2 g，攪拌均勻，靜置，待氣泡除盡，均勻涂抹在用少量液狀石蠟潤濕的光滑平整的玻璃板上，厚度為0.15 mm，于60℃干燥2 h，分割成1 cm×1 cm，即得鹽酸蘆氟沙星膜劑1 000片，每片含鹽酸蘆氟沙星2 mg，避光保存。

2.2 溶化時限考察

取2.1項下1 cm×1 cm膜劑6片，分別用兩層篩孔內徑為2 mm的不銹鋼絲夾住，按2015年版《中國藥典（四部）》通則0921崩解時限檢查法片劑項下方法檢查，結果均于15 min內全部溶化。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：EclipseXDB-C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：枸櫞酸溶液（枸櫞酸8 g與無水硫酸鈉6 g溶于1 L水中，用4.3%氫氧化鈉試液[3]調至pH 4.0）-乙腈（88∶12，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下的高效液相色譜圖見圖1，結果表明陰性對照無干擾，專屬性良好，理論板數按鹽酸蘆氟沙星峰計不低于3 000。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 溶液制備

取鹽酸蘆氟沙星對照品1.5 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容，制成質量濃度為0.150mg/mL的對照品貯備液。取鹽酸蘆氟沙星藥膜5片（相當于鹽酸蘆氟沙星10 mg），剪碎，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加蒸餾水適量，超聲處理使膜溶解，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取不含鹽酸蘆氟沙星的空白膜劑5片，剪碎，按平均片重取適量，精密稱定，同供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察

線性關系考察與檢測限、定量限確定：精密量取2.3.2項下對照品貯備液（質量濃度為0.150 mg/mL）適量，加流動相分別稀釋成質量濃度為0.120，0.090，0.060，0.030，0.015 mg/mL的對照品溶液。分別精密量取10μL，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以鹽酸蘆氟沙星的峰面積（Y）為縱坐標、進樣質量濃度（X，mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程Y=17 103X+11.45（r=0.999 9，n=5）。結果表明，鹽酸蘆氟沙星質量濃度在0.015～0.150 mg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。以3倍信噪比（S/N）為檢測限，以10倍S/N為定量限，基線噪聲為0.06147 mAU，經過計算，檢測限為0.000 23 mg/mL，定量限為0.000 78 mg/mL。

精密度試驗：精密吸取2.3.2項下對照品貯備液（質量濃度為0.150 mg/mL）10μL，注入液相色譜儀，按2.3.1項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄峰面積。結果鹽酸蘆氟沙星峰面積的RSD為1.54%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為180328）樣品6份，精密稱定，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果鹽酸蘆氟沙星含量的RSD為0.97%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為180328）樣品，精密稱定，按2.3.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，24 h時按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果鹽酸蘆氟沙星峰面積的RSD為1.31%（n=5），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品9份，依法制備供試品溶液，按鹽酸蘆氟沙星低、中、高質量濃度精密加入對照品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結果見表1。

表1 鹽酸蘆氟沙星加樣回收試驗結果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test of rufloxacin hydrochloride（n=9）

2.3.4 樣品含量測定

取3批（批號分別為180410，180411，180412）樣品，依法制備供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。根據2015年版《中國藥典（二部）》[4]《中國人民解放軍醫療制劑規范》[5]中膜劑的標示量，擬訂鹽酸蘆氟沙星膜劑的標示量為90.0%～110.0%。結果每片膜劑平均含量為（1.852±0.027）mg，3批樣品中鹽酸蘆氟沙星的含量分別為標示量的94.15%，93.15%，91.50%，RSD分別為1.34%，0.38%，1.09%（n=3）。

2.4 體外透皮試驗

2.4.1 離體鼠皮制備[6]

取雄性昆明種小鼠，6%Na2S溶液褪除背部毛，用生理鹽水洗凈皮膚，次日斷頸處死，處死后立即剝離背部皮膚，去除皮下組織和脂肪等粘連物，用生理鹽水清洗干凈，放入生理鹽水中于4℃下短期保存。使用前檢查鼠皮完整性，不得有破損。

2.4.2 體外透皮試驗[7-11]

采用改良的Franz擴散池，接收池的容量為12.5mL，有效擴散面積為2.5 cm2，以生理鹽水作為接收介質，恒溫水浴加熱，溫度控制在（37±1）℃[8]，接收池內加入磁力攪拌子，以300 r/min的速率恒速攪拌。

將處理好的小鼠皮膚固定在供給室和接收池間，角質層面向擴散池供給室一側，向接收池中加滿接收液，排除氣泡，使接收液與皮膚充分接觸，取鹽酸蘆氟沙星膜劑1片（含鹽酸蘆氟沙星2 mg），平整鋪于試驗皮膚上，開動磁力攪拌器，分別于1，2，4，8，12，24 h時取接收液2 mL（同時加入同體積、同溫度的空白接收液），采用高效液相色譜法測定接收液中鹽酸蘆氟沙星的含量，并計算累積透過量（Qn）與累積透過率（P）。

式中，Qn為第n個取樣點的累積透過量（mg），Cn和Ci為第i（i≤n-1）個取樣點的鹽酸蘆氟沙星質量濃度（mg/mL），V0為接收液的體積（mL），V為取樣量（mL）。取V0=12.5 mL，V=2 mL，結果24 h內Qn為1.383 0 mg，累積透過率為69.15%，表明鹽酸蘆氟沙星膜劑體外透皮效果良好。

精密量取接收液2 mL，置10 mL容量瓶中，加流動相定容，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。按2.3.1項下方法測定3次，記錄峰面積，以鹽酸蘆氟沙星Qn（mg）對t（h）作圖，繪制體外透皮曲線。結果見圖2。

圖2 鹽酸蘆氟沙星膜劑體外累積滲透曲線（n=3）Fig.2 In vitro cumulative permeation profile of Rufloxacin Hydrochloride Film（n=3）

3 討論

3.1 成膜材料選擇

制備膜劑的成膜材料有多種，PVA和乙烯-醋酸乙烯共聚物（EVA）是最常用的成膜材料。EVA為水不溶性高分子聚合物，PVA的水溶性大，考慮到鹽酸蘆氟沙星在水中溶解度大，故選用PVA17-88作為鹽酸蘆氟沙星膜劑的成膜材料，其在成膜性能、膜的抗拉強度、柔韌性、吸濕性等方面均較好[12]。

3.2 流動相選擇

查閱文獻發現，鹽酸蘆氟沙星含量測定方法多為紫外分光光度法和高效液相色譜法。本研究中參考原國家食品藥品監督管理總局藥品標準中鹽酸蘆氟沙星膠囊的高效液相色譜法測定條件，用枸櫞酸溶液和乙腈作為流動相，經過多次調整流動相比例，發現流動相為枸櫞酸溶液-乙腈（88∶12，V/V）時的色譜峰保留時間適宜，分離度較好。故最終選擇枸櫞酸溶液-乙腈（88∶12，V/V）作為流動相。

3.3 試驗結果評價

由于鹽酸蘆氟沙星水溶性較好，以生理鹽水作為接收介質時，經過透皮試驗，通過高效液相色譜法測定體外透皮試驗各組接收液中鹽酸蘆氟沙星的含量，計算透過率，表明鹽酸蘆氟沙星膜具有良好的昆明種小鼠皮膚透過性。