長春西汀注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法研究

賈首前，王莉芳，馮潤東，張 麗

（陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，陜西 西安 710065）

長春西汀由小蔓長春花中分離得到的一種吲哚類生物堿長春胺結(jié)構(gòu)改造而來，生物活性更高，毒副作用更小。其最早由匈牙利的Gedeon Richter藥物公司研發(fā)，并于1978年以商品名Cavinton上市，脂溶性高，呈現(xiàn)pH酸性依賴，易透過血腦屏障[1]，用于治療腦血管相關(guān)疾病認(rèn)知障礙[2]。目前，長春西汀注射劑的批準(zhǔn)文號共59個，其中注射用長春西汀37個，長春西汀注射液22個。2020年，國家抽驗評價該品種現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中既采用家兔熱原法，又采用細(xì)菌內(nèi)毒素法檢查熱原物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)熱原限值相差5倍，細(xì)菌內(nèi)毒素限值相差8倍，且在熱原檢查過程中出現(xiàn)家兔體溫降低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。長春西汀注射液/注射用長春西汀（以下稱為長春西汀注射劑）制備過程中使用了枸櫞酸、維生素C、甘露醇/山梨醇、L-酒石酸等多種輔料，輔料內(nèi)毒素的控制情況直接影響長春西汀注射劑的熱原物質(zhì)。為評估各廠家熱原物質(zhì)的整體控制情況，參照2015年版《中國藥典（四部）》中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查凝膠法[3]及文獻(xiàn)[4-9]開展長春西汀注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究，評估內(nèi)毒素檢查法替代熱原檢查法的可行性，同時建立細(xì)菌內(nèi)毒素的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；DHG-9245A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ZH-2型混旋儀（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；微量移液槍（Eppendorf公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用具（試驗所用玻璃儀器均經(jīng)250℃干烤30 min）。

1.2 試藥

鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，批號為2004012；湛江安度斯生物有限公司，批號為1908192；靈敏度均為0.25 EU/mL，規(guī)格均為每支0.1 mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE，中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-201784，規(guī)格為每支80 EU；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET用水，批號為1907020，規(guī)格為每支5 mL），堿性調(diào)節(jié)劑（批號為1903080，規(guī)格為每支2 mL），均購自湛江博康海洋生物有限公司；鎂離子緩沖液（湛江安度斯生物有限公司，批號為2002270，規(guī)格為每支4.0 mL）；氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號為20170105）；長春西汀注射液（遂成藥業(yè)股份有限公司，批號分別為11904042，11908151，11904041；注射用長春西汀（海南通用康力制藥有限公司，批號分別為11911014，11904011，11904021；云南盟生藥業(yè)有限公司，批號分別為20190201，20190303，20190301；開封康諾藥業(yè)有限公司，批號分別為D190263，D191091，D191083；山西普德藥業(yè)有限公司，批號分別為11190502，09190302，09190601）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素限值確定

2015年版《中國藥典（四部）》中細(xì)菌內(nèi)毒素限值（L）計算公式為L=K/M。式中，K為按規(guī)定給藥途徑人用每千克體質(zhì)量每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5 Eu/（kg·h）；M為人用每千克體質(zhì)量每小時最大劑量，體質(zhì)量按60 kg計。參照長春西汀注射劑藥品說明書，本品成人1次最大給藥劑量為30 mg，則L=10.0 EU/mg。由于本品屬急癥心腦血管疾病用藥，臨床用量大，故將限值確定為計算值的1/2，即5.0 EU/mg。

2.2 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）確定

目前，市售鱟試劑靈敏度為0.50～0.03 EU/mL，按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法計算公式MVD=CL/λ，C=5 mg/mL，L=5.0 EU/mg，則 MVD0.50～0.03為50～833倍（0.010～0.006 mg/mL）。

2.3 鱟試劑靈敏度復(fù)核

按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143檢查2個廠家靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑，復(fù)核結(jié)果λc均在0.5λ～2.0λ之間，符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查要求。詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核結(jié)果（EU/mL）Tab.1 Recheck results of sensitivity of limulus amebocyte lysate（EU/mL）

2.4 供試品干擾試驗預(yù)試驗

先將樣品用BET用水溶解成5 mg/mL的樣品溶液，再用BET用水和鎂離子緩沖液或0.75 mol/L氫氧化鈉溶液稀釋成50，100，200，400，800倍的供試品溶液，記為供試品陰性對照（NPC）管，樣品稀釋前后的pH見表2。另制備同樣稀釋濃度的系列稀釋液，并使每個稀釋濃度的稀釋液均含1.0 EU/mL（2λ）的內(nèi)毒素，記為供試品陽性對照（PPC）管，使用2個廠家λ均為0.5 EU/mL的鱟試劑，每個濃度分別取0.1 mL，加入用BET用水復(fù)溶的鱟試劑管中，每個濃度做2管，同時設(shè)NC管、陽性對照（PC）管，輕輕混勻，封口，放置在（37±1）℃試管恒溫儀中保溫（60±2）min。結(jié)果見表3至表4。可見，使用標(biāo)示靈敏度為0.5 EU/mL的2個廠家的鱟試劑，采用鎂離子緩沖液調(diào)節(jié)pH后，3批（批號分別為11190502，09190302，09190601）樣品在系列稀釋倍數(shù)下均對細(xì)菌內(nèi)毒素的試驗結(jié)果存在干擾作用。由于樣品均存在干擾作用，所有樣品使用0.75 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH后進(jìn)行預(yù)試驗。結(jié)果，所有樣品均對細(xì)菌內(nèi)毒素的預(yù)試驗結(jié)果無干擾作用，故最終選擇0.75 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH。

表2 長春西汀注射劑稀釋前后的p H值Tab.2 The p H value of Vinpocetine Injection before and after the dilution

表3 長春西汀注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗預(yù)試驗結(jié)果（鎂離子緩沖液，鱟試劑批號為1908192）Tab.3 Pre-test results of bacterial endotoxin interfering test of Vinpocetine Injection（magnesium ion buffer，the batch number of limulus amebocyte lysate is 1908192）

表4 長春西汀注射液劑細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗預(yù)試驗結(jié)果（鎂離子緩沖液，鱟試劑批號為2004012）Tab.4 Pre-test results of bacterial endotoxin interfering test of Vinpocetine Injection（magnesium ion buffer，the batch number of limulus amebocyte lysate is 2004012）

2.5 干擾試驗正式試驗

按2.3項下方法配制標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液，按2.4項下方法將5 mg/mL長春西汀注射劑使用BET用水和0.75 mol/L氫氧化鈉溶液制成1∶50（V/V）的溶液，同時配制1∶50（V/V）樣品溶液含細(xì)菌內(nèi)毒素濃度分別為2λ，1λ，0.5λ，0.25λ的系列溶液，每個濃度分別平行做2管和4管，按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143進(jìn)行干擾試驗。結(jié)果見表5。可見，細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)終濃度（標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液內(nèi)毒素反應(yīng)終濃度Es）均在0.5λ～2.0λ之間，細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品在長春西汀注射劑1∶50（V/V）稀釋溶液中的反應(yīng)終濃度（供試品含標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液反應(yīng)終濃度Et）均在0.5～2.0 Es之間，符合2015年版《中國藥典（四部）》對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有效性的規(guī)定。

表5 長春西汀注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗正式試驗結(jié)果（EU/mL）Tab.5 Results of bacterial endotoxin interfereing test of Vinpocetine Injection（EU/mL）

2.6 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

根據(jù)干擾試驗結(jié)果，取上述15批供試品，先用BET用水制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，再用BET用水和0.75 mol/L氫氧化鈉溶液稀釋成1∶50（V/V）的供試品溶液，使用2個廠家的鱟試劑（λ為0.5 EU/mL），按2015年版《中國藥典（四部）》通則1143項下方法進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，每1 mg長春西汀注射劑中含細(xì)菌內(nèi)毒素的量應(yīng)小于5.0 mg。結(jié)果15批供試品均為陰性，PPC管均為陽性，NC管均為陰性，PC管均為陽性，檢查結(jié)果均符合規(guī)定。

3 討論

長春西汀注射液處方工藝中均含有維生素C、甘露醇/山梨醇、L-酒石酸；注射用長春西汀處方工藝中均含有枸櫞酸、甘露醇/山梨醇等多種輔料。《美國藥典（42版）》[10]和《歐洲藥典10.0》[11]中均未收載長春西汀注射劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅有長春西汀原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中均未涉及長春西汀的熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的甘露醇對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查存在干擾作用[12-13]，參照2018年版《英國藥典》[14]中枸櫞酸細(xì)菌內(nèi)毒素限值（0.5 EU/mg），本試驗室采用0.25 EU/mL的鱟試劑確定了枸櫞酸的最大不受干擾濃度為0.5mg/mL，表明樣品中高濃度的枸櫞酸對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有抑制作用。鎂離子緩沖液作為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的輔助劑，可消除枸櫞酸鹽類抗凝劑，部分會導(dǎo)致鱟試驗反應(yīng)中二價離子缺失的樣品的干擾作用，在使用鎂離子緩沖液和堿性調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH過程中高濃度的樣品會產(chǎn)生沉淀。故在開始稀釋樣品時使用BET用水，在最后一步使用鎂離子緩沖液進(jìn)行等比稀釋，即可調(diào)整到合適的pH值，且無沉淀產(chǎn)生，與文獻(xiàn)[8]報道一致。文獻(xiàn)[5]報道了采用除熱原處理的0.75 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH來排除干擾作用。若樣品pH值過小（pH≤3.0），采用鎂離子緩沖劑不能達(dá)到適宜的pH值（pH＜6.0）時，宜采用0.75 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整到合適的pH值再進(jìn)行試驗；若樣品pH＞3.0，可考慮使用鎂離子緩沖劑調(diào)節(jié)pH。

鱟試劑反應(yīng)最適pH值為6.0～8.0，過低或過高均會干擾試驗結(jié)果[6，15]。用注射用長春西汀溶解后pH值偏低，本研究中采用稀釋法和中和法對長春西汀注射劑進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素方法學(xué)驗證，中和法建議采用0.75 mol/L氫氧化鈉溶液。結(jié)果表明，長春西汀注射劑（5 mg/mL）使用2個廠家靈敏度為0.5 EU/mL的鱟試劑，并采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法來控制其細(xì)菌內(nèi)毒素含量可行。

綜上所述，本研究中建立的長春西汀注射劑細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法合理、可行，可替代熱原檢查法，消除熱原檢查中家兔體溫降低出現(xiàn)的假陰性結(jié)果。建議將細(xì)菌內(nèi)毒素限值統(tǒng)一為5.0 EU/mg。