高效液相色譜法同時測定茵梔黃制劑中4種有效成分含量*

張 偉，孫亦釗，張娟娟，黃妍妍，王世林，陳 林，尹震花

（黃河科技學院·鄭州市天然產物合成生物學重點實驗室，河南 鄭州 450063）

茵梔黃制劑包括口服液、顆粒、軟膠囊、泡騰片、膠囊等劑型，是由茵陳、梔子、黃芩、金銀花4味中藥的提取物制成的常用中成藥制劑，由張仲景傳統中醫名方“茵陳蒿湯”加減藥味組方[1]，具有清熱解毒、利濕退黃功效，用于治療肝膽濕熱所致黃疸，癥見面目悉黃、胸脅脹痛、惡心嘔吐、小便黃赤及急、慢性肝炎見上述證候者[2]，臨床用于治療新生兒生理性和病理性黃疸、黃疸型肝炎等療效較好[3-4]。方中，茵陳主要含有綠原酸、香豆精、咖啡酸等成分，為治療肝膽疾病的主要有效成分[5]；梔子主要有效成分為環烯醚萜苷類化合物，如梔子苷、有機酸類等[6]；黃芩主要有效成分為黃酮類化合物，如黃芩苷和黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素[7]；金銀花主要有效成分為有機酸類、黃酮類、皂苷類、鞣質等化學成分[8]。茵梔黃制劑現行質量標準為2015年版《中國藥典（一部）》收載的茵陳、梔子、黃芩、金銀花提取物的質量標準，分別以對羥基苯乙酮、梔子苷、黃芩苷、綠原酸為指標進行質量控制。目前，主要對茵梔黃顆粒和口服液中的有效成分[9-14]進行研究，對比分析缺少茵梔黃膠囊制劑中有效成分及不同制劑中的有效成分含量。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定茵梔黃3種制劑顆粒劑、口服液、膠囊劑中4種有效成分綠原酸、黃芩苷、梔子苷、木犀草素的含量，并比較各制劑中的含量差異，為深入研究茵梔黃制劑的質量標準提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waterse2695型高效液相色譜儀（美國Water公司）；AG285型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為十萬分之一）；KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500W，頻率為40kHz）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為RP190531），木犀草素對照品（批號為RP181106），黃芩苷對照品（批號為RP190624），梔子苷對照品（批號為RP190629），均購自成都麥德生科技有限公司，規格為每支20 mg，純度≥98.00%；茵梔黃口服液[北京新華潤高科天然藥物有限公司，批號為191014，規格為每支10mL（含黃芩苷0.4 g）]；茵梔黃膠囊（四川百利藥業有限公司，批號為191102，規格為每粒0.33 g）；茵梔黃顆粒（魯南厚普制藥有限公司，批號為09190461，規格為每袋3 g）；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技＜中國＞有限公司）；甲醇、甲酸（均為分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：XterraMSC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10min時10%B～30%B，10～25 min時30%B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下，各成分色譜峰基線分離，與相鄰色譜峰的分離度大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test

2.2 溶液制備

取綠原酸、梔子苷、黃芩苷、木犀草素對照品各適量，精密稱定，分別加甲醇制成質量濃度為101.2，105.2，404.0，85.2μg/mL的對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液各適量，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得質量濃度分別為20.24，29.46，48.48，11.93μg/mL的混合對照品溶液。取茵梔黃膠囊內容物30.78mg、茵梔黃顆粒46.36mg，精密稱定，精密量取茵梔黃口服液80μL，分別置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）20 min，冷卻至室溫，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.22μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察[2，10]與檢測限、定量限確定：分別精密吸取2.2項下綠原酸、梔子苷、木犀草素對照品貯備液各適量，置容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得質量濃度分別為25.30，31.56，10.65μg/mL的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0μL，精密吸取黃芩苷對照品貯備液1，2，4，8，12，16μL，分別注入液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標、進樣量（X，μg）為橫坐標繪制標準曲線。用甲醇逐級多步稀釋對照品溶液，并逐一進樣，以信噪比（S/N）為3時的含量為檢測限，以S/N為10的含量為定量限。結果見表1。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果見表1，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取茵梔黃顆粒，依法制備供試品溶液，共6份，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果見表1，表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取茵梔黃顆，依法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，12，16，24 h時按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果見表1，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定。

表1 茵梔黃制劑中4種有效成分方法學考察結果Tab.1 Results of methodological investigation of four active ingredients in Yinzhihuang preparations

加樣回收試驗：取已知含量的茵梔黃顆粒，研細，每份0.4 mg，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入適量按2.2項下方法新制備的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表2。

表2 茵梔黃顆粒中4種有效成分加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of four active ingredients in Yinzhihuang Granule（n=6）

2.4 樣品含量測定

取茵梔黃顆粒、膠囊、口服液各適量，依法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定3次，并計算4種有效成分的含量。結果見表3。

表3 3批樣品中4種有效成分含量測定結果（n=3）Tab.3 Results of content determination of four active ingredients in three batches of samples（n=3）

3 討論

3.1 流動相選擇

參考文獻[15-16]，以0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相，比較了不同配比流動相對各色譜峰分離度、出峰時間、峰形等的影響。按2.1項下梯度洗脫程序，綠原酸、梔子苷、黃芩苷、木犀草素的色譜峰峰形良好，出峰時間短，基線平穩，柱壓低。故最終選擇0.1%甲酸溶液-乙腈為流動相。

3.2 檢測波長選擇

2015年版《中國藥典（一部）》中規定綠原酸、梔子苷、黃芩苷、木犀草素檢測波長分別為325，238，280，360 nm。于238，254，325，360 nm波長處供試品溶液均可檢測到綠原酸、梔子苷、黃芩苷、木犀草素，但在254 nm波長處4種有效成分均有較強吸收，且峰形良好，基線平穩，故最終選擇254 nm為檢測波長。

3.3 含量測定結果分析

2015年版《中國藥典（一部）》中規定每1 mL茵梔黃口服液中含黃芩苷34～46 mg，梔子苷不得少于0.80 mg；每粒茵梔黃膠囊中含黃芩苷120.0～147.0 mg，梔子苷不得少于1.6 mg，綠原酸不得少于1.2 mg；每袋茵梔黃顆粒中含黃芩苷180～220 mg，梔子苷不得少于3.0 mg，綠原酸不得少于1.8 mg[2]。本研究中茵梔黃口服液、顆粒、膠囊中綠原酸和梔子苷的含量均符合規定，而黃芩苷的含量略高。這可能與提取方法、檢測條件、標準品來源等不同有關。另外，茵梔黃制劑是由4種提取物組成，不同含量組合制成的制劑，測定每種制劑中相應化合物的含量與測定其中的含量略有不同，也會與本研究結果有一定誤差。

3.4 方法評價

該方法操作簡單，靈敏度高，重復性好，穩定可靠，可用于同時測定茵梔黃顆粒、口服液、膠囊中綠原酸、梔子苷、黃芩苷、木犀草素4種有效成分的含量，同時可為后續研究茵梔黃制劑中的有效活性成分提供參考。