DHEA誘導的PCOS大鼠中高雄激素對肝細胞凋亡影響的初步探索

張婷婷，高慧民，谷牧青，劉瑞霞，李天鶴，陰赪宏

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院，北京 100026)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期女性最常見的婦科內分泌疾病，發病率為5%～20%，以高雄激素血癥、排卵功能障礙和卵巢多囊樣改變為主要臨床特征，并可伴有多毛癥、凝血功能異常、代謝功能異常等表現[1-2]。由于代謝功能異常，大多數PCOS患者會出現胰島素抵抗(IR)或代謝綜合征的表現，如肥胖、血脂異常、高血壓、高胰島素血癥和血糖失調[3-4]。近年來，已有多項研究證明，PCOS患者中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的發生率明顯高于普通人群[5-7]，且高雄激素血癥、肥胖、IR和高胰島素血癥同樣可促進NAFLD的發生發展[8-10]。所以，NAFLD和PCOS分別被認為是代謝綜合征累及肝臟、卵巢的表現。鑒于兩者發病機制相似且具有高度的臨床相關性，有專家由此提出“肝-卵巢軸”的概念[11]，提示我們PCOS患者肝臟受損可能與其PCOS疾病本身有關。但是在PCOS動物模型，特別是脫氫表雄酮(DHEA)誘導的PCOS大鼠模型中，肝功能的變化以及影響因素尚不明確。

細胞凋亡是一種在進化上高度保守的細胞死亡途徑，正常情況下，在機體發育過程中發揮適當剔除細胞和維持體內穩態的重要作用[12]，當細胞凋亡過程調節障礙時，可導致體內多種疾病的發生[13]。肝細胞凋亡與各種肝臟疾病，如病毒性肝炎、肝硬化、肝癌以及NAFLD之間的關系日益受到關注。人們逐漸認識到細胞凋亡是肝臟常見疾病細胞死亡的常規模式[14]。Beclin-1和Lamin B1蛋白與細胞凋亡聯系緊密。當細胞生存環境發生缺乏生長因子或饑餓等異常變化時，Beclin-1蛋白可被激活并誘導凋亡的發生[15]。Lamin B1蛋白可作為Caspase-6的特異性天然作用底物，與其共同促進細胞的凋亡[16]。

因此，本研究利用DHEA構建PCOS大鼠模型，通過分析PCOS大鼠內分泌代謝水平、血清生化水平、肝臟組織結構和表達蛋白的變化，初步了解PCOS大鼠模型中肝細胞凋亡在肝臟損傷過程中所起的作用，以期為今后PCOS相關疾病的研究提供一定參考。

材料與方法

一、實驗動物

3周齡SD雌性大鼠20只，購買并飼養在譜尼測試集團股份有限公司，動物許可證號為SCXK(京)2016-0002。SPF級屏障系統飼養，溫度為24～26℃，濕度為50%～70%，光照黑暗時間比為12 h/12 h，常規食水飼養。所有實驗動物操作流程符合美國國家衛生研究院(NIH)規定的實驗動物福利和道德規定。

二、主要試劑和儀器

DHEA(D8950，北京索萊寶科技)，睪酮(MC12987)、雌二醇(MC12312)、黃體生成素(MC12403)、卵泡刺激素(MC12313)的ELISA檢測試劑盒均購自北京美辰聯創生物科技有限公司，谷草轉氨酶(AST)試劑盒和谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Beclin-1、Lamin B1及β-tublin兔源單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司，甲醇(北京化工廠)，4%多聚甲醛(G1101，武漢賽維爾生物科技)，瑞氏染色液(S7030，北京酷來博科技)；顯微鏡(CKX41，Olympus，日本)，胰島素耐量的穩態模型評估使用Accu-Chek’O血糖儀(羅氏，美國)，酶標儀(Spark 10M，Tecan，瑞士)。

三、實驗方法

1.實驗分組：選取3周齡SD大鼠，隨機分為正常對照組、DHEA組，每組10只，參照之前文獻方法[17]，分別給予頸部皮下注射油劑、6 mg/100 g DHEA，1次/d，連續注射21 d。造模第22天，將兩組大鼠各分為處死取材和動情周期觀察兩部分，每組7只大鼠處死并取材，每組3只大鼠繼續進行動情周期觀察。每7 d稱量一次大鼠體重。

2.取材：大鼠造模第22天，將大鼠麻醉，股動脈取血并分離血清待測。頸椎脫臼法處死大鼠后，將新鮮的卵巢和肝臟組織固定于4%多聚甲醛，24 h后用于HE染色和Masson染色。

3.大鼠動情周期觀察：參照文獻方法[18]，從大鼠給藥第22天開始，每天上午8∶00～10∶00進行陰道涂片檢查(連續8 d)：將無菌棉簽在生理鹽水中浸濕后，放入大鼠陰道側璧的前1/3處順時針方向涂抹一周，取出棉簽后沿同一方向涂抹到玻片上，瑞氏法染色后，鏡檢。動情前期涂片特征：絕大部分是小、圓的有核上皮細胞，偶有少量角化細胞；動情期：大部分是無核、不規則的角化細胞，間有少量上皮細胞；動情后期：有核細胞、角化細胞、白細胞均有；動情間期：出現大量白細胞和少量的上皮細胞。大鼠如失去規律的動情周期，或持續處于動情間期，則提示無排卵。

4.大鼠血清生殖激素水平檢測：取各組血清按照ELISA試劑盒說明書檢測黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)含量，用酶標儀(Spark 10 M，Tecan，瑞士)于波長450 nm下檢測其OD值。

5.大鼠血清生化檢測：取各組血清按照試劑盒說明書檢測AST、ALT含量，用酶標儀于波長510 nm下檢測其OD值；取各組血清按照試劑盒說明書檢測ALP含量，用酶標儀于波長405 nm下檢測其OD值。

6.HE染色：將取到的兩組卵巢和肝臟組織固定于4%多聚甲醛24 h后，常規石蠟包埋、切片，HE染色后再普通光學顯微鏡下觀察，記錄染色結果。

7.Masson染色：將取到的兩組肝臟組織固定于4%多聚甲醛24 h后，常規石蠟包埋、切片、透明、脫水、染色和封片。Masson染色后在普通光學顯微鏡下觀察，記錄肝臟組織纖維化程度。每次實驗中每組選取3～4只大鼠，每次實驗任意選取3～4張切片。

8.蛋白質印跡法(WB)測定肝臟組織蛋白表達變化：取正常對照組、DHEA組肝臟組織，用蛋白裂解液提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白樣品濃度。等量的蛋白利用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，電轉移至 PVDF 膜。用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，分別加入 Beclin-1、Lamin B1的一抗(1∶2 000稀釋)中，4℃孵育過夜；次日，回收一抗后，洗膜3次，分別加入山羊抗兔的二抗(1∶5 000稀釋)中，室溫孵育2 h，洗膜3次，將膜置于增強化學發光(ECL)法檢測試劑中，凝膠成像系統顯影。以目的蛋白條帶灰度值與內參照β-tublin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

四、統計學分析

結 果

一、大鼠動情周期情況及卵巢病理學變化

利用6 mg/100 g DHEA注射油針劑連續頸部皮下給藥21 d后，連續8 d取陰道細胞進行涂片及鏡下觀察，發現動情前期時存在小、圓、有核鱗狀上皮細胞；動情期時存在不規則(角質化)鱗狀上皮細胞；動情后期和動情間期時存在白細胞、角質化細胞和圓上皮細胞。且陰道涂片結果顯示，對照組大鼠具有規律性動情周期，而DHEA組大鼠動情周期失調，大部分時間處于動情前期和動情后期，提示無排卵(圖1)。HE染色結果顯示，對照組大鼠卵巢組織鏡下可觀察到3個正常黃體和處于不同時期的多個正常卵泡，而DHEA組大鼠鏡下未觀察到黃體，且觀察到3個囊性卵泡(圖2)。說明DHEA組大鼠卵巢組織發生多囊樣改變且效果顯著，PCOS大鼠模型構建成功。

圖示分別為兩組內某大鼠連續8 d陰道涂片檢查結果：紅色箭頭示不規則角質化鱗狀上皮細胞；藍色箭頭示有核鱗狀上皮細胞圖1 兩組大鼠的陰道涂片結果(瑞氏染色，×10)

#示黃體；*示囊狀卵泡圖2 兩組大鼠的卵巢結構(HE染色，×10)

二、兩組大鼠血清生殖激素水平比較

收集大鼠空腹血清，利用ELISA試劑盒檢測血清中生殖激素水平。結果顯示，DHEA組大鼠血清中T值[(28.65±6.31)nmol/L]顯著高于對照組大鼠[(0.40±0.29)nmol/L](P=0.001)，而兩組大鼠的FSH、LH和E2水平均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組大鼠血清生殖激素水平比較(-±s)

三、兩組大鼠體重及胰島素抵抗能力的比較

連續給藥期間，兩組大鼠體重比較無顯著性差異(P>0.05)(圖3A、B)。利用胰島素耐量試驗(ITT)檢測大鼠胰島素抵抗情況，結果顯示，DHEA組在0 min、15 min、30 min、45 min、60 min的血糖值均略高于對照組，但尚無統計學意義(P>0.05)(圖3C)；DHEA組ITT的曲線下面積(AUC)顯著大于對照組(P=0.031)(圖3D)。表明PCOS大鼠較對照組葡萄糖清除能力下降，對胰島素的敏感性降低。

A：兩組大鼠體重變化的比較；B：處死前兩組大鼠體重的比較；C：兩組大鼠ITT實驗結果的比較；D：兩組大鼠ITT的AUC比較。與對照組比較，*P<0.05圖3 兩組大鼠體重及葡萄糖清除能力的比較

四、兩組大鼠肝臟結構及纖維化程度比較

兩組大鼠肝臟的大體結構見圖4A。與對照組相比，DHEA組大鼠肝臟重量、肝臟/體重比顯著增加(P=0.001)(圖4B、C)，提示肝臟腫大。利用HE染色觀察肝臟組織結構，結果顯示，對照組大鼠肝細胞核大小正常，核質淡染，肝小葉結構清晰完整，肝索放射狀分布于中央靜脈周圍；DHEA組大鼠肝細胞間結構疏松，染色變淺可見少量脂滴形成，中央靜脈周圍有少量炎細胞浸潤(圖4D)。利用Masson染色觀察肝纖維變化，結果顯示，對照組大鼠肝臟中央靜脈和匯管區無膠原纖維，DHEA組大鼠肝臟中央靜脈周圍出現少量藍色膠原纖維(圖4E)。

進一步通過檢測血清ALT、AST、ALP水平來評估兩組大鼠的肝功能，結果顯示，DHEA組大鼠血清ALT水平顯著高于對照組(P=0.042)。兩組大鼠血清AST、ALP水平均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

A：兩組大鼠肝臟外形比較；B：兩組大鼠肝臟重量/體重比較；C：兩組大鼠肝臟重量比較；D：兩組大鼠HE染色比較(HE染色，×10)；E：兩組大鼠Masson染色比較(Masson染色，×10)。與對照組比較，*P<0.01 圖4 兩組大鼠肝臟組織的重量及結構比較

表2 兩組大鼠血清生化指標水平比較(-±s)

五、兩組大鼠肝臟組織中凋亡相關蛋白表達分析

應用WB檢測兩組大鼠肝臟組織中的凋亡相關蛋白Beclin-1和Lamin B1，結果顯示，DHEA組大鼠Beclin-1和Lamin B1蛋白的相對表達量顯著高于對照組(P=0.001；P=0.002)(圖5)。

A：對照組；B：DHEA組。與對照組比較，*P<0.01圖5 兩組大鼠肝臟組織中Beclin-1和Lamin B1蛋白的表達

六、ALT、AST、ALP水平與T值的相關性分析

為進一步探索PCOS肝損傷的原因，利用Pearson相關性分析血清T值與轉氨酶之間的相關性。結果顯示，ALT與T值之間存在顯著正相關(r=0.606)；AST與T值之間存在正相關，但相關程度較弱(r=0.112)；ALP與T值之間存在負相關，但相關性極弱(r=-0.108)(表3)。

表3 ALT、AST、ALP水平與T值的相關性分析

討 論

已有多項研究證實，在PCOS患者中NAFLD的發病率較高，可達34%～70%，而NAFLD在一般人群中的發病率僅為14%～34%[7-9，19]。在長期來曲唑處理的PCOS大鼠中，雄激素增加可引發肝功能損傷[20]。我們的研究在DHEA誘導的PCOS大鼠中證實，高雄激素血癥是導致DHEA誘導的PCOS大鼠模型中肝損傷的重要誘因。實驗結果顯示，相較于對照組，DHEA組大鼠血清T水平顯著升高(P=0.001)，而兩組大鼠的FSH、LH和E2水平均無統計學差異(P>0.05)。這表明，DHEA誘導的PCOS大鼠血清中T值升高為其主要的性激素變化特征。同時 DHEA組大鼠血清ALT水平顯著高于對照組(P=0.042)，提示PCOS大鼠肝功能不全。肝臟HE染色和Masson染色顯示PCOS大鼠肝臟結構受損，有炎癥性改變和纖維化形成；且DHEA組大鼠ALT與T值具有顯著相關性(r=0.606)，表明高雄激素血癥可導致PCOS大鼠肝功能障礙。

研究表明，高雄激素血癥PCOS患者的肝臟脂肪含量高于雄激素正常的PCOS患者[21]。但目前為止，PCOS患者中高雄激素血癥是如何影響NAFLD發生發展的機制尚不完全清楚。有報道推測，高雄激素血癥可直接影響肝臟中的低密度脂蛋白受體，從而使PCOS患者更易發生血脂異常和NAFLD[22]。此外，雄激素也可能直接影響脂肪因子的產生，從而參與PCOS的代謝改變[23]。同時，也有研究表明與單純NAFLD患者相比，PCOS伴有NAFLD患者血清中的特異性凋亡標記物M30水平顯著升高[24]，這提示我們PCOS 患者的肝臟損傷可能是由于高雄激素血癥通過促進其凋亡途徑而發生發展。基于此，我們研究了PCOS大鼠肝臟組織凋亡蛋白Beclin-1和Lamin B1的表達量。Beclin-1基因也稱BECN1基因，是酵母自噬相關基因At96/Vps30的哺乳動物同源基因，位于人類染色體17q21位點。Beclin-1基因可通過其BH3結構域與凋亡抑制因子Bcl-2蛋白結合，使Bcl-2與促凋亡蛋白Bax解離，從而誘導細胞凋亡[15]。核纖層蛋白是核纖層的關鍵形成部分之一，而核纖層則對維持細胞核形態有關鍵作用[16]。Lamin B1是一類細絲狀多肽，也核纖層蛋白的成分之一，在維持核仁的完整性和可塑性上起重要作用，其又作為Caspase-6的特異性天然作用底物可在酶切后改變其結構，可共同促進細胞的凋亡[25]。我們的研究結果顯示，PCOS大鼠肝組織中凋亡相關蛋白Beclin-1和Lamin B1蛋白的相對表達量較對照組顯著升高(P<0.01)，提示PCOS大鼠肝臟組織凋亡增加。據此，我們推測在PCOS大鼠肝臟受損過程中，肝細胞存在凋亡過程且可能是由于PCOS大鼠中高雄激素血癥所致。

綜上所述，本研究利用DHEA構建PCOS大鼠模型，通過分析PCOS大鼠內分泌代謝水平、血清生化水平、肝臟組織結構和表達蛋白的變化，研究結果表明PCOS大鼠模型中肝細胞凋亡在肝臟損傷過程中起到一定的作用，并推測其可能是由于高雄激素水平所致。本研究為今后PCOS相關疾病的研究和診療提供了一定參考。