鈣離子載體輔助卵母細(xì)胞激活在卵胞漿內(nèi)單精子注射中的應(yīng)用

孫濤，楊曉玉，冒韻東，蔡令波，劉嘉茵

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床生殖醫(yī)學(xué)中心 南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210029)

卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)是人為將精子直接注射入卵母細(xì)胞質(zhì)以達(dá)到受精的目的，該技術(shù)為男性不育患者帶來(lái)了希望。盡管，ICSI技術(shù)可以取得較高的受精率和卵裂率，但仍有1%～5%的患者可能發(fā)生完全受精失敗(total fertilization failures，TFF)，并在臨床中反復(fù)發(fā)生，這一問(wèn)題給醫(yī)生和患者帶來(lái)了一定壓力[1]。有研究表明，40%的ICSI受精失敗歸因于卵母細(xì)胞激活失敗(oocyte activation failure，OAF)[2]。輔助卵母細(xì)胞激活(artificial oocyte activation，AOA)可以有效治療因OAF引起的受精失敗，并獲得正常發(fā)育的胚胎[3]。由于鈣離子載體AOA具有非侵入性和操作便利性，其在臨床上應(yīng)用最為廣泛。

目前，鈣離子載體AOA對(duì)行ICSI時(shí)未受精或受精低下患者的作用效果尚沒(méi)有大規(guī)模臨床研究，對(duì)子代安全性問(wèn)題也存在爭(zhēng)議[4]。鈣離子載體能否提高第1個(gè)ICSI周期AOA助孕患者的受精率，既往的研究也比較少。因此，本文回顧性分析了本中心行ICSI時(shí)采用鈣離子載體(A23187)AOA助孕患者的臨床資料，通過(guò)分析臨床妊娠結(jié)局及新生兒健康情況，以評(píng)估該技術(shù)的有效性和安全性，為以后深入研究鈣離子載體AOA對(duì)子代長(zhǎng)期安全性的影響提供參考，以期更好地服務(wù)于臨床。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2012年1月至2020年12月于我院因受精不良或精子因素行ICSI助孕時(shí)使用鈣離子載體AOA患者的臨床資料。本研究共納入115個(gè)激活周期。根據(jù)采用鈣離子載體AOA的時(shí)間不同分為2組：第1個(gè)ICSI周期使用鈣離子載體AOA助孕的為A組(n=66)和第2個(gè)ICSI周期才使用鈣離子載體AOA助孕的為B組(n=49)。同時(shí)，以同期于我中心就診的未使用激活劑的不同精子來(lái)源ICSI周期為A組的對(duì)照組，以自身既往未使用激活劑的ICSI周期為B組的對(duì)照組。

AOA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：成熟的卵母細(xì)胞≥3枚；行ICSI；行ICSI時(shí)采用了鈣離子載體(A23187)AOA助孕。A組對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：成熟的卵母細(xì)胞≥3枚；行常規(guī)ICSI；配偶精子活力差、畸形率高，配偶為無(wú)精子癥時(shí)采用手術(shù)取精。排除標(biāo)準(zhǔn)：成熟的卵母細(xì)胞<3枚，卵母細(xì)胞質(zhì)量差或畸形。

本研究數(shù)據(jù)來(lái)源于我院臨床生殖醫(yī)學(xué)管理系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)(CCRM)。

二、研究方法

1.控制性促排卵：根據(jù)患者情況選擇長(zhǎng)方案或拮抗劑方案。當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡(直徑≥18 mm)達(dá)50%或雌激素達(dá)3 000 pmol/L時(shí)，肌內(nèi)注射5 000～10 000 U HCG(珠海麗珠)，36～38 h后在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵[5]。

2.精液收集和處理：按照本中心常規(guī)流程，少弱精子癥患者采用手淫法收集精液，精液液化后，采用單層梯度離心或300g室溫離心15 min，將沉淀下來(lái)的精子混勻，備用。無(wú)精子癥患者通過(guò)外科手術(shù)穿刺附睪和睪丸獲取樣本，300g室溫離心10 min，將沉淀下來(lái)的精子混勻，備用。

3.ICSI助孕：對(duì)照組卵母細(xì)胞按常規(guī)ICSI流程處理[6]。采用鈣離子載體AOA的卵母細(xì)胞在行常規(guī)ICSI注射30 min后，轉(zhuǎn)入鈣離子載體A23187激活液(C9275-1MG，Sigma，美國(guó))中，在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，之后轉(zhuǎn)入卵裂培養(yǎng)液(Cleavage Medium，Cook，美國(guó))中繼續(xù)培養(yǎng)。

4.卵裂期胚胎和囊胚評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵裂期胚胎評(píng)分。根據(jù)卵裂球數(shù)目、形態(tài)和碎片情況對(duì)D3胚胎進(jìn)行評(píng)分[5]，具體分為4級(jí)：Ⅰ級(jí)：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻、數(shù)目均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)空泡，碎片<5%；Ⅱ級(jí)：胚胎發(fā)育速度正常，卵裂球均勻或大致均勻，數(shù)目均等或大致均等，細(xì)胞質(zhì)均一、無(wú)空泡，碎片5%～10%；Ⅲ級(jí)：胚胎發(fā)育速度大致正常，卵裂球不均勻或均勻、數(shù)目不均等或均等，細(xì)胞質(zhì)中有少量空泡，碎片10%～15%；Ⅳ級(jí)：胚胎發(fā)育速度異常，卵裂球不均勻、數(shù)目不均等，細(xì)胞質(zhì)不均一、有大量空泡，碎片15%～50%。評(píng)分為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)胚胎為可移植胚胎。根據(jù)D3胚胎評(píng)分和患者雌激素水平及內(nèi)膜厚度，選擇1～2枚胚胎進(jìn)行移植，移植后常規(guī)黃體支持。對(duì)于移植后有剩余胚胎的患者，經(jīng)其知情同意后行囊胚培養(yǎng)或胚胎冷凍。(2)囊胚評(píng)分。本中心囊胚評(píng)分采用Gardner評(píng)分系統(tǒng)[7]，評(píng)分級(jí)別高于CC的囊胚，可以移植或冷凍；評(píng)分低于CC的囊胚，其胚胎發(fā)育潛能降低，根據(jù)情況決定是否移植或冷凍。

5.臨床結(jié)局判斷：移植后14 d檢測(cè)血β-HCG，若β-HCG≥25 U/L為陽(yáng)性；移植4周后行超聲檢查，見(jiàn)原始心管搏動(dòng)及孕囊判定為臨床妊娠；妊娠12周內(nèi)胚胎停止發(fā)育或發(fā)生妊娠物排出則診斷為早期流產(chǎn)；妊娠滿28周且至少有1個(gè)存活新生兒定義為活產(chǎn)。隨訪至胎兒出生，記錄妊娠患者分娩情況及胎兒情況。

6.觀察指標(biāo)：比較各組的一般資料和臨床結(jié)局。2PN受精率=2PN卵母細(xì)胞數(shù)/ICSI注射MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)×100%；2PN卵裂率=卵裂胚胎數(shù)/2PN卵母細(xì)胞數(shù)×100%；優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵母細(xì)胞數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的基本臨床資料比較

兩組間女方平均年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)FSH值和E2水平比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 患者基本臨床資料比較(-±s)

二、A組患者中不同精子來(lái)源兩組與對(duì)照組臨床結(jié)局比較

A組患者根據(jù)不同精子來(lái)源分為2個(gè)亞組，采用外科手術(shù)穿刺獲取的精子為手術(shù)組，采用手淫法獲取的精子為嚴(yán)重少弱精子癥組；并以同期于我中心就診的未使用激活劑的不同精子來(lái)源ICSI周期作為對(duì)照組。比較兩組中激活組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局。

在手術(shù)組和嚴(yán)重少弱精子癥組中，激活組2PN受精率均顯著高于同組對(duì)照組(P<0.05)，而促性腺激素(Gn)使用總量、Gn使用天數(shù)、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和胚胎種植率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 A組患者中不同精子來(lái)源兩組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

三、B組患者中不同既往ICSI情況組與對(duì)照組臨床結(jié)局比較

B組患者根據(jù)第1次ICSI受精情況不同分為3個(gè)亞組：前次ICSI助孕受精失敗(非精子因素)的為未受精組(n=12)，前次ICSI助孕受精率低的為受精低下組(n=31)和前次ICSI助孕因精子質(zhì)量差導(dǎo)致受精失敗的為精子因素組(n=6)；并分別以自身既往未使用激活劑的ICSI周期為對(duì)照組。比較3組中激活組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局。

在未受精組中，對(duì)照組無(wú)正常受精卵形成，而激活組2PN受精率高達(dá)73.26%，并最終有8例活產(chǎn)；受精低下組中，激活組2PN受精率和2PN卵裂率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)；精子因素組中，激活組2PN卵裂率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)、2PN受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 B組患者中不同既往ICSI情況組與對(duì)照組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

續(xù)表

四、新生兒出生情況

在采用鈣離子載體(A23187)AOA的115個(gè)周期中，共有22例患者順利分娩24例活產(chǎn)兒，其中20例單胎，2例雙胎，單胎和雙胎平均孕周分別為(38.35±1.76)周和(32.50±2.12)周，單胎和雙胎嬰兒的平均出生體重為(3 466.00±482.19)g和(2 030.00±608.11)g，24例活產(chǎn)兒中有1例早產(chǎn)兒(31周)，其余均為足月兒，新生兒出生時(shí)健康狀況良好，未見(jiàn)先天缺陷和畸形。

討 論

本文研究結(jié)果表明，在采用鈣離子載體AOA后，嚴(yán)重少弱精子癥和手術(shù)取精患者2PN受精率顯著提高(P<0.05)，且既往ICSI未受精或受精低下患者2PN受精率和卵裂率也顯著提高(P<0.05)，最終增加了患者移植成功的希望。

在正常受精過(guò)程中，精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后，精子特異性磷脂酶C-zeta(PLC-ζ)會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度發(fā)生持續(xù)數(shù)小時(shí)短暫升高，這個(gè)過(guò)程被稱為卵母細(xì)胞的“鈣震蕩”[8]。卵母細(xì)胞鈣震蕩會(huì)引發(fā)大量生化反應(yīng)事件，如釋放皮質(zhì)顆粒、重排細(xì)胞骨架、募集母系mRNA以及形成原核，這個(gè)過(guò)程稱為卵母細(xì)胞激活。激活后的卵母細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)受精過(guò)程并完成第2次減數(shù)分裂，排出第二極體，開(kāi)啟后續(xù)的胚胎發(fā)育過(guò)程[9]。哺乳動(dòng)物受精后，鈣震蕩是卵母細(xì)胞激活的直接原因[10]。研究表明，觸發(fā)鈣震蕩的PLC-ζ是引起正常受精的關(guān)鍵分子[11]。精子PLC-ζ異常表達(dá)和定位會(huì)導(dǎo)致未受精或受精低下[12-13]。

根據(jù)導(dǎo)致OAF的原因不同可分為精源性和卵源性因素。精源性因素主要是精子特異性卵母細(xì)胞激活因子異常，卵源性因素主要是卵母細(xì)胞激活信號(hào)通路異常[2]。PLC-ζ是主要的精子特異性卵母細(xì)胞激活因子，精子PLC-ζ低水平表達(dá)是導(dǎo)致受精失敗的主要原因之一。Tavalaee等[12]檢測(cè)了32例因DPY19L2基因缺失導(dǎo)致圓頭精子癥患者的精子，發(fā)現(xiàn)PLC-ζ在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)水平均低于正常男性。卵母細(xì)胞成功激活除了PLC-ζ還需要4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)、三磷酸肌醇受體(IP3R)、蛋白激酶C和鈣離子等卵母細(xì)胞激活信號(hào)通路相關(guān)物質(zhì)的參與，其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)的出錯(cuò)都可能導(dǎo)致OAF的發(fā)生[14-15]。

當(dāng)卵母細(xì)胞存在激活障礙時(shí)，可采用AOA。AOA主要包括物理激活法、化學(xué)激活法和電刺激法。而應(yīng)用鈣離子載體A23187的化學(xué)激活法是目前最常用的方法。嚴(yán)重少弱精子癥患者采用ICSI并聯(lián)合鈣離子載體AOA助孕可獲得正常受精胚胎，最終獲得臨床妊娠[6]。AOA還可應(yīng)用于圓頭精子癥、不活動(dòng)精子和嚴(yán)重形態(tài)異常精子患者行ICSI[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，行ICSI采用鈣離子載體AOA后，嚴(yán)重少弱精子癥組和手術(shù)組2PN受精率均顯著提高(P<0.05)。雖然行ICSI時(shí)采用鈣離子載體AOA顯著提高了受精率，但臨床妊娠率和胚胎種植率并沒(méi)有得到顯著提高(P>0.05)，因此，對(duì)于嚴(yán)重少弱精子癥治療周期使用鈣離子載體AOA可能需要進(jìn)一步研究。一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，鈣離子載體AOA可以提高ICSI周期的受精率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率等[16]。既往ICSI周期的受精率情況是衡量是否需要AOA的重要指標(biāo)之一。有研究提示，對(duì)于上個(gè)ICSI周期受精率>30%的患者，行ICSI-AOA助孕后患者的受精率和臨床妊娠率得到顯著提高[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣離子載體AOA對(duì)既往ICSI周期未受精、受精低下(≤30%)患者的受精率、卵裂率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均有顯著提高作用，與既往的研究結(jié)果[18-19]一致。這也證明了通過(guò)鈣離子載體AOA可以提高行ICSI時(shí)未受精或受精低下患者的臨床妊娠機(jī)會(huì)。

由于鈣離子載體AOA只能激發(fā)產(chǎn)生單個(gè)瞬時(shí)的鈣離子峰，無(wú)法完全模擬自然受精生理過(guò)程中的鈣離子周期性震蕩和頻率。這可能會(huì)改變鈣離子調(diào)控通路下游特殊蛋白和酶的活性，影響胚胎的形成和發(fā)育。目前，鈣離子載體AOA是否安全仍需要更多的深入研究。Long等[18]的一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，ICSI-AOA與傳統(tǒng)的ICSI比較，新生兒先天缺陷或先天缺陷類型(染色體畸變和非染色體畸變)患病率沒(méi)有顯著差異。Vanden Meerschaut等[19]對(duì)21例行ICSI-AOA獲得的新生兒進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，新生兒在語(yǔ)言和神經(jīng)發(fā)育方面均在正常范圍內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，利用鈣離子載體AOA技術(shù)分娩的子代，在孕周、出生性別比、新生兒體質(zhì)量方面均未見(jiàn)顯著異常。在本研究中我們只隨訪到胎兒早期健康情況，對(duì)鈣離子載體AOA子代安全性仍需要更多的長(zhǎng)期隨訪研究。目前鈣離子載體AOA的安全性還存在爭(zhēng)議，相關(guān)的臨床研究證據(jù)也比較少，所以在臨床應(yīng)用前必須充分與患者溝通，保證在患者充分知情同意后方可進(jìn)行。

綜上所述，本研究認(rèn)為鈣離子載體AOA可以有效提高嚴(yán)重少弱精子癥、手術(shù)取精、既往ICSI未受精和受精低下患者的受精率，改善前次因精子因素不育患者的卵裂率。在沒(méi)有更理想的卵母細(xì)胞激活障礙治療手段之前，鈣離子載體AOA仍將是治療嚴(yán)重少弱精子癥、手術(shù)取精、既往ICSI未受精或受精低下患者的有效方法之一。