單囊胚移植策略對凍融周期臨床結局的影響

李昕妍，柴三明，李甫云，王琰，王志強，張霖，晏博，楊金偉，倪亞莉

(甘肅省婦幼保健院生殖醫學中心，蘭州 730050)

近年來輔助生殖技術飛速發展，為了提高臨床妊娠率，有些中心采取多胚胎移植，一定程度上導致多胎妊娠率增加。研究顯示，輔助生殖技術助孕后的多胎妊娠率高達25%～30%[1]。多胎妊娠率的逐年上升已成為早產、流產、圍產兒發病率和死亡率增加以及妊娠期高血壓及前置胎盤等并發癥增加的重要原因。多胎妊娠不但危害母兒健康，而且為患者自身及社會增加經濟負擔[2-3]。在體外受精過程中，根據胚胎發育天數不同分為卵裂期胚胎和囊胚。從卵裂期胚胎發育到囊胚，經過了初步淘汰，囊胚移植后妊娠結局較卵裂期移植有一定提高，且單囊胚移植也降低了多胎妊娠率。如何更好的應用單囊胚移植，提高妊娠結局，是生殖醫生關注的熱點問題。由于形態學評估參數及冷凍解凍策略存在差異，目前單囊胚移植還未形成共識[4]。因此，本研究旨在探討單囊胚移植冷凍、解凍策略及胚胎學評估參數中對凍融胚胎臨床結局的主要影響因素，探索囊胚冷凍、解凍及移植的最佳策略。

資料與方法

一、研究對象及分組

回顧性分析2016年1月至2020年10月期間在甘肅省婦幼保健院生殖中心接受凍融周期單囊胚移植患者的周期資料，所有囊胚采用玻璃化冷凍復蘇法進行冷凍、復蘇。納入標準：(1)凍融周期為激素替代周期內膜準備方案；(2)囊胚為D5或D6的單囊胚，擴張程度在3期以上；(3)解凍后存活且擴張程度達1/2以上的囊胚；(4)排除胚胎植入前遺傳學檢測(preimplantation genetic testing，PGT)周期。

共納入979個周期，分別按照發育天數、內細胞團(ICM)評分、滋養層細胞(TE)評分級別和解凍后體外培養時間進行分組比較。按照發育天數分為D5組(n=520)和D6組(n=459)；按照囊胚ICM評分不同分為A1組(ICM細胞數目多，排列緊密，n=54)、B1組(細胞數目少，排列松散，n=526)和C1組(細胞數目很少，n=399)；按照TE評分不同分為A2組(上皮細胞層由較多的細胞組成，結構致密，n=58)、B2組(上皮細胞層由不多的細胞組成，結構松散，n=759)和C2組(上皮細胞層由稀疏的細胞組成，n=162)；按照解凍后體外培養時間分為D5解凍后培養2～4 h組(n=320)、D5解凍后培養16～20 h組(n=200)、D6解凍后培養2～4 h組(n=182)和D6解凍后培養16～20 h組(n=277)。

二、研究方法

1.囊胚冷凍與解凍：囊胚冷凍與解凍分別采用玻璃化冷凍、解凍方法，冷凍使用Itrification Kit試劑盒(Kitazato公司，日本)，解凍使用Thawing Kit試劑盒(Kitazato公司，日本)，按照試劑盒操作說明進行操作。囊胚冷凍前應先行人工皺縮，冷凍D5或D6 級別為3BC/3CB及以上的可利用囊胚。

2.囊胚評分：使用Gardner評分系統，根據囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚分為6個時期，對于處于3至多期的囊胚，還需對其ICM和TE進行質量分級，以便對囊胚的狀況進行較全面的評定。

3.激素替代周期準備內膜：于月經周期第2天起使用雌激素(芬嗎通，蘇威制藥，荷蘭)，3 mg每日兩次，7 d后每3～5 d行B超監測內膜厚度，用藥10～12 d當內膜厚度≥8 mm時加用孕激素(黃體酮注射液，浙江仙琚)使內膜轉化為分泌期。轉化前需評估內膜厚度、形態、抽血測激素水平。應用黃體酮3～5 d后解凍行囊胚移植，并持續黃體支持。

4.分類決策樹模型：采用SPSS 23.0卡方自動交互檢驗(CHAID)，指定項：以是否妊娠為因變量，以發育天數、ICM、TE和解凍后體外培養時間為自變量，年齡為影響變量來建立模型。

三、統計學分析

結 果

一、D5和D6凍融周期單囊胚移植臨床結局比較

本研究共納入979個周期的患者資料，其中D5囊胚組520例，D6囊胚組459例。兩組間患者年齡、不孕類型、內膜厚度及內膜類型均無顯著差異(P>0.05)，D5組臨床妊娠率顯著高于D6組(P<0.05)(表1)。

表1 D5與D6囊胚移植患者一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

二、不同ICM級別對臨床結局的影響

ICM級別不同的3組患者間年齡具有顯著差異(P<0.05)，經LSD進一步統計分析，細胞數目很少的C1組患者年齡顯著高于其他兩組(P<0.05)；不孕類型、內膜厚度及內膜類型在3組間均無顯著差異(P>0.05)；A1、B1、C1組的臨床妊娠率呈逐漸下降趨勢，兩兩比較均具有顯著差異(P<0.05)(表2)。

表2 ICM評分不同的患者一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

三、不同TE級別對臨床結局的影響

TE評分不同的3組患者間年齡、不孕類型、內膜厚度及內膜類型均無顯著差異(P>0.05)；A2、B2、C2組的臨床妊娠率呈逐漸下降趨勢，兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表3 TE細胞評分不同的患者一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

四、囊胚解凍后不同培養時間對妊娠結局的影響

D5囊胚解凍后不同培養時間組間年齡、內膜類型均無顯著差異(P>0.05)，不孕類型及內膜厚度有顯著差異(P<0.05)，解凍后培養2～4 h組的臨床妊娠率顯著高于16～20 h組(P<0.05)；D6囊胚解凍后不同培養時間組間年齡、內膜厚度、內膜類型均無顯著差異(P>0.05)，不孕類型存在顯著性差異，同樣解凍后培養2～4 h組的臨床妊娠率顯著高于16～20 h組(P<0.05)(表4)。

表4 囊胚解凍后不同體外培養時間組間的一般情況及臨床妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

五、臨床妊娠率多因素分析

經Logistic分析得出，女方年齡、ICM評分、TE評分、發育天數與臨床妊娠率呈負相關(P<0.05)，解凍后培養2～4 h與臨床妊娠率呈正相關(P<0.05)(表5)。

表5 妊娠結局多因素分析

六、分類決策樹模型結果

模型中納入體外發育天數、解凍后體外培養時間、ICM及TE評分為自變量，結果表明決策樹分2層，共生成4個節點：第一層為ICM級別(A、B級 vs. C級，P=0.000，χ2=49.438)，第二層為解凍后培養時間(培養16～20 h vs.培養2～4 h，P=0.011，χ2=6.502)，交叉驗證正確百分比為35.8%(圖1)。

Adj：調整后統計值；n：周期數；節點1為ICM評分A或B級囊胚，節點2為ICM評分C級囊胚，節點3和4為節點1的子節點，分別表示解凍后2～4 h和解凍后16～20 h圖1 分類決策樹

討 論

囊胚大多在胚胎發育至第5天和第6天形成，國內外很多學者就胚胎發育天數對妊娠結局的影響進行了研究，但仍存在很大爭議[5-6]。漆倩榮等[7]認為凍融周期D6囊胚移植可達到和D5囊胚相近的妊娠結局，就凍融周期而言，發育天數對妊娠結局無顯著影響。本研究比較了D5囊胚和D6囊胚的妊娠結局，發現D5囊胚組的妊娠率明顯高于D6囊胚組，Logistic回歸分析顯示發育天數與臨床妊娠率有相關性，這與Elgindy等[8]的研究結果一致，可能是由于D6囊胚的異常紡錘體發生率高于D5囊胚，其非整倍體率增高[9]，從而導致D6囊胚臨床妊娠率低于D5囊胚。另外D6囊胚較D5囊胚發育遲緩，在體外培養時間較長，可能導致DNA損傷，后續發育潛能下降[10]。

在囊胚移植過程中，選擇發育潛能好的囊胚是獲得更好的臨床結局的關鍵因素。在移植周期中，囊胚質量是首要考慮的因素。目前形態學評分仍為評價胚胎質量的主要方法，囊胚形態學評分通常使用Gardner評分體系[11]。在胚胎發育過程中，隨著囊胚的形成分化成兩個具有明顯差異的細胞群ICM和TE。Gardner評分體系主要以囊胚擴張程度、ICM和TE級別做為評價指標，多種影響因素增加了胚胎實驗室挑選胚胎的難度。

本研究發現ICM級別不同的3組患者間年齡和臨床妊娠率具有顯著差異(P<0.05)。ICM級別A、B兩組的患者年齡均小于C組，而妊娠率均高于C組。Logistic分析結果顯示，ICM級別低是影響臨床妊娠率的危險因素，并且分類決策樹第一層為ICM級別，ICM級別 A、B級與C級比較臨床妊娠率有顯著性差異(P<0.05)。因此，在單囊胚移植時我們應該首先考慮ICM級別。國內也有研究表明，在囊胚發育天數、ICM評分與TE評分這3個變量中，僅ICM評分對臨床結局有影響，因此ICM是決定囊胚發育潛能的主要因素[12]。

關于ICM和TE對于臨床結局的相對影響，目前仍然尚未定論。Thompson等[13]認為TE的級別和患者年齡是影響臨床結局重要的獨立預測因素。國內學者陳清汾等[14]亦發現，對于非優質囊胚而言，TE評分低者，臨床妊娠率降低、流產率升高。在本研究中TE級別不同的3組患者間臨床妊娠率具有顯著差異(P<0.05)。Logistic分析結果顯示，TE級別是影響臨床妊娠率的危險因素，但是分類決策樹指定項中加入TE為自變量，結果中沒有TE這一節點，這可能是由于本研究中TE級別大多為B級[占總數的77.53%(759/979)]所導致。并且張亞楠等[15]發現囊胚ICM及TE評級與活產率呈負相關，在行凍融周期單囊胚移植時，為獲得較好的臨床結局，應挑選ICM與TE評分較高的囊胚。位于囊胚內部的ICM保持多能性，隨后發育為卵黃囊和胚體；位于囊胚外部的細胞分化為TE，增殖后發育成胎盤等外胚器官，利于著床。ICM后期發育為胎兒本身，但如果沒有功能性TE建立的著床，后期在母體內的生長就很難發生，挑選胚胎時就有一定的難度[16]。因此，在單囊胚移植時應該按照分類決策樹提供的參考排除ICM為C級的囊胚，首先挑選ICM級別高的囊胚，再選擇TE級別高的囊胚。

目前玻璃化冷凍技術應用廣泛，各中心解凍策略也有所不同。有的中心解凍后2～4 h 移植，有的中心則提前解凍后培養16～20 h移植。Fang等[17]認為解凍后培養時間對妊娠結局無明顯影響。而習海濤等[18]的研究中，解凍后培養16～20 h的囊胚孵化率高達86.5%，而解凍后4 h 的囊胚孵化率僅有41.8%。有研究認為已經孵化好的比正在孵化的囊胚具有更好的發育潛能并且可以獲得更好的臨床結局[19]。這可能與解凍后培養16～20 h后會淘汰一部分發育潛能不良、趨向凋亡的囊胚有關。

本研究結果顯示，囊胚解凍后2～4 h 移植的臨床妊娠率顯著高于囊胚解凍后培養16～20 h移植。Logistic回歸分析顯示，解凍后體外培養時間是影響妊娠率的重要因素，并且分類決策樹顯示ICM級別為A、B級的囊胚解凍后2～4 h 移植的臨床妊娠率顯著高于解凍后培養16～20 h組(P<0.05)。因此D5囊胚和D6囊胚解凍后當天移植較解凍后培養16～20 h移植的臨床結局有所改善。劉軍霞等[20]也認為D5冷凍囊胚解凍后2～4 h 移植的臨床結局優于解凍后16～20 h 移植，這可能與囊胚解凍后培養16～20 h再移植，體外培養時間過長增加了囊胚損傷的可能性有關[21]。因此，建議解凍后培養時間不宜過長。有文獻報道D6囊胚解凍后16～20 h 移植妊娠率低的原因可能是由于囊胚在體外培養天數延長，導致促凋亡基因BAX表達增加，從而增加了凋亡的風險[22]。

朱序理等[23]運用分類決策樹模型選擇凍融周期胚胎移植，交叉驗證正確百分比為57.8%，而本研究中分類決策樹模型交叉驗證正確率僅為35.8%，可能與模型中納入的自變量較多有關。并且胚胎移植后臨床結局影響因素較多，女性年齡、內膜厚度、不孕年限、不孕原因、患者子宮內環境、機體免疫狀態、移植過程等均可對胚胎移植后臨床結局產生影響。通過本模型的分析，可以利用胚胎形態學主要參數選擇最佳單囊胚移植策略，但還具有一定的局限性。

本研究所涉及的研究對象為凍融周期單囊胚移植，排除移植胚胎數目對臨床結局的影響，并且采用激素替代周期，排除了新鮮周期不同促排卵方案對子宮內膜容受性的影響，以盡量減少組間混雜因素對妊娠結局的影響。為了排除年齡對后續結果的影響，將其納入自變量進行二分類Logistic回歸分析，結果顯示女方年齡、囊胚體外發育時間、ICM及TE評級和解凍后體外培養時間對凍融周期單囊胚移植的臨床結局都有一定的影響。本研究中分類決策樹模型交叉驗證正確百分比低于50%，主要是因為影響臨床結局的因素不僅僅是囊胚質量和發育速度，還有其他很多因素。

本研究仍存在局限性。首先，樣本量較少，還需擴大樣本量進一步研究；其次，囊胚形態學評分受主觀因素影響較大，不同操作者評分可能存在一定差異，并且在本研究中ICM多為B、C級，TE多為B級，因此結果可能存在偏倚，有待進一步觀察；第三，臨床妊娠結局受多種因素的影響，本研究納入的自變量較少，未將患者的不孕年限、囊胚凍存時間、受精方式、體質量指數(BMI)、活產率等納入研究，以探究可能的影響因素，以便選擇最佳的單囊胚移植策略提高臨床妊娠率。

綜上所述，建議囊胚解凍后2～4 h 移植，在挑選單囊胚時，建議根據ICM級別優先選擇ICM評分為A、B級的D5囊胚，再根據TE級別選擇TE評分為A、B級的囊胚。