玻璃化冷凍技術(shù)積累卵母細胞在卵巢低反應(yīng)患者中的應(yīng)用分析

閆瑾，唐莉，趙樹華，楊文娟，姚有林

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖遺傳科，昆明 650032)

人卵母細胞冷凍保存技術(shù)主要應(yīng)用于人類輔助生殖及女性生育力的保存。Chen[1]首次報道應(yīng)用慢速程序化方法冷凍人卵母細胞，并成功獲得妊娠及分娩，這為女性生育力保存提供了全新的思路。但是，由于卵母細胞具有體積大、水分含量多、細胞膜滲透性低、紡錘體對溫度改變敏感[2]等結(jié)構(gòu)特點，同時，也由于冷凍保存技術(shù)本身的限制，因此，人卵母細胞冷凍技術(shù)在臨床中的應(yīng)用發(fā)展相對緩慢。Kuleshova等[3]應(yīng)用玻璃化冷凍技術(shù)冷凍卵母細胞，卵母細胞解凍后獲得了成功妊娠。之后，國外進行了大量卵母細胞冷凍保存技術(shù)的研究探索并顯著地提高了妊娠結(jié)局。近30余年來，隨著卵母細胞冷凍保存技術(shù)從慢速程序冷凍轉(zhuǎn)換為玻璃化冷凍，以及冷凍保護劑的改進和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)的出現(xiàn)，卵母細胞冷凍保存的臨床妊娠率逐漸提高，卵母細胞冷凍保存技術(shù)成為可在臨床開展的技術(shù)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，人類卵母細胞的慢速冷凍會影響紡錘體的正常形態(tài)而使染色體排列紊亂，導(dǎo)致受精后非整倍體胚胎的增加[5]。然而，F(xiàn)orman等[6]研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞玻璃化冷凍不增加胚胎非整倍體風(fēng)險。盡管有文獻提示，卵母細胞玻璃化冷凍后出生的嬰兒與自然受孕/新鮮卵受精嬰兒比較其圍產(chǎn)兒不良結(jié)局無顯著差異[7-8]，但冷凍卵母細胞保存技術(shù)的遠期安全性目前尚無大量流行病學(xué)資料證實。卵母細胞冷凍保存技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，但國內(nèi)由于多種原因，開展卵母細胞冷凍保存的醫(yī)院較少，有關(guān)卵母細胞冷凍保存應(yīng)用的文獻報道也很少[9]，并且多數(shù)研究納入的樣本量小，未考慮患者年齡及卵巢儲備功能等因素，甚至缺少自身對照組數(shù)據(jù)。

卵巢低反應(yīng)(POR)是在控制性卵巢刺激(COS)中卵巢對外源性促性腺激素反應(yīng)不良的狀態(tài)。POR人群多為高齡、卵巢儲備功能下降人群，其特點是該人群的獲卵數(shù)少，臨床上常需要多個周期取卵積累胚胎。冷凍卵母細胞解凍后與下一周期獲得的新鮮卵母細胞同時行ICSI授精，可為POR患者節(jié)約1次培養(yǎng)和ICSI費用。本研究回顧性分析2016年1月至2020年7月于我院因POR采用玻璃化冷凍技術(shù)積累卵母細胞，并于凍卵后下一周期新鮮取卵，冷凍卵母細胞解凍后與新鮮卵母細胞同時行ICSI患者的臨床資料，探討玻璃化冷凍技術(shù)積累卵母細胞在POR患者中的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2016年1月至2020年7月于我院因POR采用玻璃化冷凍技術(shù)積累卵母細胞，并于凍卵后下1個周期新鮮取卵，冷凍卵母細胞解凍后與新鮮卵母細胞同時行ICSI的69例患者的臨床資料。

納入標準：(1)因POR采用玻璃化冷凍技術(shù)積累卵母細胞；(2)冷凍卵母細胞后下一周期新鮮取卵，將冷凍卵母細胞解凍后與新鮮卵母細胞同時行ICSI助孕的周期。排除標準：(1)無可用卵母細胞的新鮮取卵周期；(2)前后2個周期間隔>1年。

本研究共納入69例患者(138個取卵周期)。根據(jù)行ICSI的卵母細胞來源不同分為2組：行ICSI時采用冷凍卵母細胞受精的為凍卵組(69個周期)，行ICSI時采用新鮮卵母細胞受精的為鮮卵組(69個周期)。所有患者在進行卵母細胞玻璃化冷凍前，均被充分告知卵母細胞冷凍相關(guān)風(fēng)險并簽署知情同意書，既往治療前均獲得昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核同意。

二、方法

1.促排卵方案：根據(jù)患者年齡、基礎(chǔ)性激素水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)目(AFC)、抗苗勒管激素(AMH)等指標個性化選擇促排卵方案，包括長方案、拮抗劑方案，卵泡期高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案、自然周期方案、微刺激方案等，使用促性腺激素促排卵過程中超聲監(jiān)測卵泡生長，同時監(jiān)測性激素水平，根據(jù)卵泡直徑和性激素水平變化決定扳機時機，扳機后34～36 h經(jīng)陰道超聲下取卵。之前的周期促排卵取卵后行卵母細胞玻璃化冷凍，如卵巢內(nèi)仍有直徑8～10 mm的小卵泡，繼續(xù)黃體期促排，如不滿足，擇期行下一周期COS。

2.卵母細胞玻璃化冷凍：取卵后1～2 h內(nèi)進行玻璃化冷凍。冷凍前先對卵母細胞進行脫顆粒處理并進行成熟度和形態(tài)學(xué)評估[10]。 選取MⅡ期卵母細胞冷凍。采用玻璃化冷凍試劑盒(VT101，加藤，日本)冷凍卵母細胞，實驗步驟嚴格按照說明書進行。在培養(yǎng)皿上做1個30 μl G-MOPS液滴(PH穩(wěn)定試劑)和3個30 μl ES液滴，將卵母細胞放入G-MOPS液滴中并與第1個ES液滴相連，放置3 min；與第2個ES液滴相連，放置3 min；將卵母細胞移入新的ES液滴，放置3 min；移入VS液，放置30 s；吸出卵母細胞并快速放置在載體上(加藤，日本)并立即投入液氮中備用。整個冷凍過程在室溫下進行。

3.卵母細胞解凍及ICSI助孕：卵母細胞解凍采用快速解凍方法。使用玻璃化解凍試劑盒(加藤，日本)解凍卵母細胞，實驗步驟嚴格按照說明書進行。將裝有冷凍卵母細胞的全封閉載桿從液氮罐中取出，迅速將載桿前端放有卵母細胞的載片放入TS中1 min，將卵母細胞移入DS中2.5 min，移入WS1中2.5 min，移入WS2，最后將卵母細胞移入平衡過夜的G-IVF培養(yǎng)液中，觀察卵母細胞復(fù)蘇情況。卵母細胞復(fù)蘇2～3 h進行ICSI授精。

4.胚胎移植：行ICSI授精17 h后觀察原核(PN)確定受精情況，每天進行胚胎形態(tài)學(xué)評估，記錄受精卵數(shù)、正常受精卵數(shù)、卵裂數(shù)、胚胎評分及等級。胚胎評分標準[11]如下：Ⅰ級：卵裂球大小均勻，胞質(zhì)均勻清晰，碎片<5%；Ⅱ級：卵裂球大小略不均勻，形態(tài)略不規(guī)則，碎片<20%；Ⅲ級：卵裂球大小不均勻，可有明顯的形態(tài)不規(guī)則，碎片<50%；Ⅳ級：卵裂球大小嚴重不均勻，胞質(zhì)可有嚴重的顆?，F(xiàn)象，碎片>50%。不滿足新鮮胚胎移植條件的(促排方案為黃體期促排或PPOS方案；子宮內(nèi)膜不均、子宮內(nèi)膜厚度>14 mm或<7 mm；HCG日孕酮>4.8 nmol/L；患者出現(xiàn)卵巢過度刺激、出血、感染或其他身體異常等情況)，行全胚冷凍后進行凍融胚胎移植(FET)，如無上述情況，進行新鮮胚胎移植。根據(jù)胚胎評分首選胚胎評分高的優(yōu)質(zhì)胚胎移植，如凍卵來源及新鮮卵來源胚胎評分相同，優(yōu)先移植新鮮卵來源胚胎，綜合評估患者的具體情況，每移植周期移植1～2枚優(yōu)質(zhì)胚胎或可利用胚胎，移植后均給予黃體支持。

5.妊娠結(jié)局的判斷：移植后14 d檢測血β-HCG，若β-HCG≥5 U/L為陽性；移植后4周超聲下可見孕囊判定為臨床妊娠。

6.觀察指標：比較各組患者的復(fù)蘇率、正常受精率、卵裂率及D3優(yōu)質(zhì)胚胎率。復(fù)蘇率=復(fù)蘇后存活卵母細胞數(shù)/解凍卵母細胞數(shù)×100%，正常受精率=2PN受精卵數(shù)/ICSI卵母細胞總數(shù)×100%，卵裂率=2PN來源卵裂胚胎數(shù)/2PN受精卵總數(shù)×100%，D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=2PN來源優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)(Ⅰ級+Ⅱ級)/2PN受精卵總數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者的基本資料

納入患者的平均年齡為(38.65±5.36)歲，平均AMH水平為(0.96±0.51)ng/ml，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.57±3.06)kg/m2，AFC(5.22±2.51)個，F(xiàn)SH(9.08±4.21)U/L。

二、凍卵組和鮮卵組實驗室指標比較

納入患者之前共有冷凍MⅡ卵母細胞121枚(凍卵組)，凍卵時長為28(11，59)d，卵母細胞解凍后的復(fù)蘇率為96.69%(117/121)；之后獲得新鮮MⅡ卵母細胞190枚(鮮卵組)。

兩組間正常受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 凍卵組和鮮卵組實驗室指標比較[(-±s)，%]

三、不同移植胚胎來源組間臨床妊娠率比較

69例患者中部分患者因子宮因素、個人因素或無優(yōu)質(zhì)胚胎未進行移植，移植周期共66個。根據(jù)移植胚胎來源不同分為3組：只移植凍卵來源胚胎的為凍卵胚胎組(9個周期)、移植胚胎既有凍卵來源又有新鮮卵來源的為混合胚胎組(30個周期)，只移植新鮮卵來源胚胎的為鮮卵胚胎組(27個周期)。

各組間平均年齡和平均移植胚胎數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)；鮮卵胚胎組的臨床妊娠率稍高于其他兩組，但尚無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同移植胚胎來源組間臨床妊娠率比較[(-±s)，%]

討 論

目前，對卵母細胞冷凍復(fù)蘇后是否具有和新鮮卵母細胞同樣的實驗室指標及臨床結(jié)局還存在較大的爭議。本研究發(fā)現(xiàn)，冷凍卵母細胞解凍后與新鮮卵母細胞的受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率等重要實驗室指標比較無顯著性差異(P>0.05)，這與Cobo等[12]的研究結(jié)果一致。本研究玻璃化冷凍卵母細胞的復(fù)蘇率為96.69%(117/121)，這與既往報道的冷凍卵母細胞復(fù)蘇率(74.4%～94.0%)結(jié)果存在較大差異[9，13]。分析其可能原因如下：首先，由于各中心采用的玻璃化冷凍技術(shù)、操作方法以及冷凍保存液的配比不同；其次，由于納入研究的卵母細胞成熟度不同，有研究發(fā)現(xiàn)，GV期卵母細胞的冷凍效果要好于MⅡ期卵母細胞[14]；另外，各研究中心對冷凍卵母細胞形態(tài)學(xué)評估標準的差異也可能影響最終卵母細胞的復(fù)蘇率。但總體來看，已報道的冷凍卵母細胞的復(fù)蘇率大多可達90%以上。卵母細胞玻璃化冷凍保存技術(shù)作為一種相對較新的技術(shù)，其卵母細胞復(fù)蘇率能否達到或接近胚胎復(fù)蘇率也存在較大爭議。目前，已報道的卵母細胞復(fù)蘇率差異較大，而胚胎玻璃化冷凍技術(shù)則更成熟，近年來報道的卵裂期胚胎冷凍復(fù)蘇率為90.0%～98.8%不等[15]。本研究中的卵母細胞復(fù)蘇率為96.7%，接近胚胎復(fù)蘇率。胚胎復(fù)蘇后存在完整性受損情況，王永衛(wèi)等[16]報道復(fù)蘇后胚胎完整率約為79.6%，胚胎完整性受損會導(dǎo)致胚胎發(fā)育潛能下降。本研究發(fā)現(xiàn)，凍卵胚胎組的臨床妊娠率相對于鮮卵胚胎組、混合胚胎組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與佘宏等[17]的研究結(jié)果一致。但是，考慮到本研究所納入的凍卵胚胎組樣本量較少，后續(xù)需增加樣本量進一步驗證。Siano等[13]將同一取卵周期獲得的卵母細胞隨機分為凍卵組和新鮮組，冷凍組卵母細胞冷凍20 min解凍后，同時行ICSI授精，兩組間受精率和種植率比較無顯著性差異，但凍卵組卵裂率顯著低于新鮮組，考慮可能因為卵母細胞在短時間內(nèi)反復(fù)經(jīng)歷冷凍解凍刺激有關(guān)。

目前，關(guān)于卵母細胞冷凍時限與妊娠結(jié)局的研究不多，且多數(shù)研究是采用慢速冷凍方法。卵母細胞冷凍后獲得活產(chǎn)的最長時限報道為14年[18]。本研究納入的最長玻璃化冷凍時長為210 d(約7個月)，平均冷凍時長為28(11，59)d，但由于本研究樣本量少，卵母細胞冷凍時長跨度較小，無法明確冷凍時長對妊娠結(jié)局的影響，卵母細胞玻璃化冷凍時長對復(fù)蘇率和妊娠結(jié)局的影響仍需要進一步的研究。

有研究發(fā)現(xiàn)，>35歲患者卵母細胞冷凍后臨床妊娠率及最終活產(chǎn)率較低[19]，因此，不建議對>35歲女性進行卵母細胞冷凍。《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》臨床指南也指出理想的凍卵年齡為30～35歲[20]。盡管本研究顯示，凍卵組獲得了滿意的復(fù)蘇率和胚胎質(zhì)量，但對于高齡POR人群，卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)是否與新鮮卵母細胞行ICSI具有相似的臨床妊娠結(jié)局仍需前瞻性研究來進一步證實。

本研究以自身為對照，具有完全相同的操作時間、操作技師、培養(yǎng)皿及培養(yǎng)條件，避免了這些因素對實驗結(jié)果的影響，是本研究的優(yōu)勢。但本研究仍存在以下不足：(1)本研究雖為自身對照，但兩組不是同一個取卵周期獲得的卵母細胞，不能排除促排卵方案不同對結(jié)果的影響，這是本研究的局限之一；(2)本研究為回顧性研究，因設(shè)計問題，未將凍卵來源胚胎全部單獨移植，單獨凍卵來源胚胎移植周期僅9個周期，因樣本量少臨床妊娠率統(tǒng)計結(jié)果的可靠性不高，且缺少流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、活產(chǎn)率等重要妊娠結(jié)局指標，這是本研究的另一局限。

綜上所述，卵母細胞玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于POR人群可以獲得滿意的卵母細胞復(fù)蘇率、正常受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率，且可與鮮卵來源胚胎移植得到相似的臨床妊娠率，或可成為POR人群積累胚胎的另一選擇。但基于凍卵胚胎單獨移植樣本量較少，且未統(tǒng)計流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等重要妊娠結(jié)局指標，卵母細胞玻璃化冷凍后對妊娠結(jié)局及出生子代的長期安全性是否有影響需更大樣本量的研究來明確。