生命早期應激對青春期雄性大鼠下丘腦-垂體-性腺軸的影響

張瑩，馬佳男，王佳麗，方靖漪，張長勇

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.中國中醫科學院，北京 100700)

隨著醫學研究從傳統的生物醫學模式向生物-心理-社會醫學模式的轉變，社會環境和精神狀態等因素引起的心理應激與疾病發生以及轉歸的關系引起了研究者們的廣泛興趣。生命早期應激(Early life stress，ELS)指在子宮內或出生后早期遭受的刺激，其往往能導致成年后行為表型的異常[1-2]。既往研究發現，ELS造成模型動物下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)功能紊亂，并對模型動物的神經、內分泌、免疫系統以及精神行為造成遠期的影響[3]。下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPG)是調控機體生殖功能的神經內分泌系統[4]，ELS是否影響HPA軸進而影響生殖功能，尚未見研究報道。本研究利用大鼠ELS模型——限制筑窩材料和墊料(limited nesting model，LN)模型，觀察ELS對雄性大鼠睪丸組織及性激素水平的影響，探討ELS對青春期生殖系統的影響。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物：SPF級SD孕鼠購自北京維通利華實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。動物實驗室溫度保持為(22±2)℃，相對濕度保持為(60±10)%，屏障環境，孕鼠單籠飼養，自由進水和食物。本實驗已通過倫理委員會實驗動物倫理審查。

2.主要試劑和儀器：LN模型所用材料均為自制。網架為塑封鋁架，下有支架，高2.5 cm，網格直徑1 cm×5 cm，網架尺寸為20 cm×33 cm，與鼠籠長寬相同，保證母鼠及仔鼠置于網架上，不會掉漏。筑窩材料多層紗布為自縫制。光學顯微鏡(BX51，Olympus，日本)。皮質酮(cortisol，CORT)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)、睪酮(T)和雌二醇(E2)激素放射免疫檢測試劑盒購自北京北方生物技術研究所。

二、研究方法

1.動物分組與處理：孕鼠隨機分為對照組(4只)和模型組(4只)，每只孕鼠產仔鼠8～14只，其中對照組母鼠共產出雄性仔鼠28只，模型組母鼠共產出雄性仔鼠26只，用于實驗。對照組新生SD大鼠正常飼養。模型組新生SD雄性大鼠行ELS即LN模型構建[5]，并適當調整。具體過程如下：分娩當日記為PND0(postnatal day 0)，依此類推，出生后第2天為PND2。從PND2開始，對照組母鼠及其仔鼠置于籠內，籠內有標準數量的玉米皮墊料，并配有一塊10 cm×10 cm的多層紗布，母鼠會將其撕碎，混同墊料構成一個巢穴供其飼養仔鼠。模型組母鼠及其仔鼠的籠內放入網架平臺，平臺下面是谷殼墊料，墊料高度不超過平臺，母鼠及其仔鼠置于平臺上，平臺上放置5 cm×5 cm的多層紗布。有限筑窩材料和墊料妨礙母鼠筑窩，使其撫育行為不可預測、片段化，對仔鼠造成持續的慢性應激。應激持續到PND9，從PND10開始，兩組大鼠的筑窩材料和墊料均恢復正常。PND2～14及PND16、PND18、PND21測量仔鼠體重及尾長，評估仔鼠生長發育情況。

2.曠場實驗：實驗裝置為自制的80 cm×80 cm×40 cm立方形敞箱，周圍各壁和底面涂為黑色，底面由白線劃分為25塊面積相等的正方形。實驗在安靜暗光的環境中進行，于PND21將28只對照組大鼠和26只模型組大鼠放入行為箱正中央格，計時5 min。將大鼠在后3 min內穿行的水平格數記為水平運動得分(穿越1格為1分)，兩后肢站立的次數作為垂直運動得分(站立1次為1分)，并記錄大鼠修飾動作次數及持續時間，每只動物僅檢測1次。

3.血清CORT及性激素水平檢測：曠場實驗結束后第2天，取對照組大鼠15只，模型組大鼠13只，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，4℃，3 000 r/min離心15 min，分離獲得血清，-20℃保存備用。采用放射性免疫法測定血清CORT含量。剩余13只對照組大鼠及13只模型組大鼠于PND42同方法麻醉取血，放射性免疫法測定血清GnRH、FSH、LH、E2和T含量。

4.取材及組織處理：于PND42取材剩余對照組大鼠13只及模型組大鼠13只，稱量體重，麻醉后取大鼠雙側睪丸稱重，計算睪丸指數。睪丸指數=睪丸濕重(g)/體重(g)×100%。一側睪丸剔除被膜后，取1/2體積睪丸組織，多聚甲醛固定、石蠟包埋，做常規組織切片，HE染色，光學顯微鏡觀察睪丸組織病理學改變。

三、統計學分析

結 果

一、ELS對大鼠體重及尾長的影響

統計結果顯示，對照組與模型組PND2仔鼠的體重及尾長均無統計學差異(P>0.05)；PND2～9持續不良生活環境處理后，PND10模型組仔鼠體重及尾長均顯著低于對照組(P<0.05)，且體重的顯著性差異可持續到PND21(P<0.01)，尾長的顯著性差異可持續到PND18(P<0.05)(表1)。

表1 對照組與模型組仔鼠的體重及尾長比較(-±s)

二、ELS對大鼠自主活動的影響

PND21時仔鼠行曠場試驗。與對照組相比，模型組仔鼠水平運動得分和垂直運動得分顯著下降(P<0.05)；修飾次數無顯著變化，但模型組仔鼠修飾行為持續時間延長，差異有統計學意義(P<0.01)(表2)。

表2 對照組與模型組仔鼠的自主活動比較(-±s)

三、ELS對大鼠睪丸濕重、睪丸指數及睪丸組織形態的影響

統計結果顯示，與對照組相比，PND42模型組大鼠體重、睪丸濕重及睪丸指數均顯著下降(P<0.05)(表3)。

表3 兩組大鼠體重、睪丸濕重和睪丸指數的比較(-±s)

睪丸組織HE染色結果顯示，PND42對照組大鼠曲細精管呈圓形或橢圓形，排列規則，曲細精管中生精細胞排列整齊，層次清楚，曲細精管間可見間質組織，富含血管和淋巴管(圖1A、B)。模型組大鼠間質組織萎縮，間質細胞數量減小，生精小管間連接疏松，生精小管中出現空泡，生精細胞間間隙增加(圖1C、D)。提示ELS造成了大鼠睪丸組織損傷。

圖1 對照組(A、B)和模型組(C、D)大鼠睪丸組織HE染色

四、ELS對大鼠血清CORT及性激素水平的影響

PND22時，模型組仔鼠血清CORT含量(20.00±1.14)ng/ml，顯著低于對照組的(23.14±2.46)ng/ml，差異有統計學意義(P<0.001)。

PND42時檢測兩組大鼠血清GnRH、LH、FSH、E2和T含量。與對照組相比，模型組仔鼠血清GnRH和LH水平顯著升高，而E2和T水平顯著下降(P<0.05)；兩組大鼠的血清FSH水平無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 兩組仔鼠血清性腺激素水平的比較(-±s)

討 論

生命早期機體比其他時期更容易受到環境有害因素的影響。本研究以新生雄性仔鼠為受試對象，應用經典ELS模型——LN模型觀察ELS對青春期雄鼠性腺軸的影響。結果顯示，LN模型大鼠睪丸指數顯著下降，睪丸間質組織細胞數量減少，血清雄激素水平下降，初步結果表明ELS引起雄性大鼠生殖系統功能損傷。

一種合理穩定的動物模型對加深ELS的了解和認識非常必要。常見的ELS模型有母嬰分離模型、母愛剝奪模型和限制筑窩材料和墊料模型。前兩種模型廣泛應用，增加了我們對ELS造成的遠期影響的理解，但這兩種模型在模擬ELS方面存在部分缺陷：首先，母嬰分離的時間和年齡沒有標準化；其次，母嬰分離過程中沒有母鼠的存在，幼崽的保暖和飲食會成為母嬰分離應激以外的其他應激因素存在于造模過程中；再次，經歷母嬰分離的母鼠在回籠后會代償性增加對仔鼠的撫育行為，這種行為變化很難通過實驗來控制[6]。以上因素造成前兩種模型所產生的實驗結果出現分歧和矛盾。此外，來自人類的研究表明，經歷戰爭、饑荒和忽視/虐待的幼兒，他們的母親通常是存在的，只是行為不正常。因此，前兩種模型不能很好的模擬人類的情況[5]。近年來提出的LN模型，通過限制筑窩材料和墊料，阻礙母鼠建造滿意的巢穴，使母鼠的撫育行為片段化，不穩定。這種不可預測性的、片段化的撫育行為給仔鼠造成持續性應激。該模型能更好地模擬人類因早期生活貧困、生存條件惡劣所導致的母性撫育不良[7-8]。

體重是反映身體發育的良好指標，而尾長則是代表線性骨骼生長的指標[9]。應激仔鼠體重增加明顯減少，尾長增長明顯放緩，提示ELS致仔鼠身體生長緩慢，類似于兒童的發育不良。曠場試驗是評價試驗動物在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度的一種常用方法。PND21曠場試驗結果顯示模型組大鼠運動減少，修飾整理時間增加，表現出抑郁焦慮狀態。血清CORT水平降低，提示大鼠HPA軸功能失調。這些結果進一步支持了LN模型大鼠在精神行為方面有重要改變，與既往研究[1-3]相符。同時也證實了該模型適用于本研究。

HPG是男性生殖系統的核心。下丘腦產生GnRH，刺激垂體產生FSH和 LH，作用于睪丸，啟動生精功能，并促進T分泌及第二性征發育[10]。外周T水平又負反饋作用于下丘腦和垂體，調節內分泌激素，使得機體的激素水平相對穩定，維持正常功能發揮。睪丸間質細胞是T合成的重要場所，大約95%的T是在此合成的[11]。睪丸間質細胞有兩種類型：胚胎期睪丸間質細胞和成年睪丸間質細胞。但胚胎期睪丸間質細胞不會向成年睪丸間質細胞轉化，而是在出生后兩周左右消失[12]。成年睪丸間質細胞來源于間質干細胞，睪丸間質干細胞分化為成年睪丸間質細胞的關鍵時期是幼鼠哺乳期[13]，在青春期時形成。青春期是身心發育的特殊時期，也是生殖系統發育成熟的關鍵階段。雄性大鼠青春期的劃分依據雄性前列腺袋皮膚皺褶分離的時間，約在出生后第35天開始[14]。本研究選取模型應激時間為哺乳期，觀察青春期大鼠生殖系統變化。結果顯示LN模型大鼠睪丸指數下降，睪丸間質組織萎縮，間質細胞數量減小，生精小管間連接疏松，血清T水平明顯下降。提示ELS影響雄性大鼠睪丸間質細胞，造成雄性大鼠生殖功能受損；同時血清T水平明顯下降，GnRH和LH水平升高，提示HPG軸功能失調。這些結果提示，ELS造成生殖系統損傷，HPG軸功能失調。

T的合成起始于膽固醇的轉運，甾體激素生成急性調節蛋白StAR將線粒體外膜的膽固醇轉運到線粒體內膜，在一系列酶的作用下轉化為T[15]，T在酶的作用下可進一步轉化為E2。T和E2可共同作用于機體，維持機體的生殖健康。本研究中LN模型組大鼠T水平下降，負反饋增加了血清GnRH和LH的水平，但是升高的GnRH和LH并沒有實現調節T水平至正常值，而是T和E2水平均低于對照組，提示T和E2合成過程可能受阻，具體機制還需進一步探索。

綜上所述，ELS造成雄性大鼠生殖系統損傷，HPG軸功能失調，具體機制待進一步探索。