脾腎陽虛證狼瘡性腎炎繼發骨質疏松癥的代謝組學研究

劉明嶺，鄧日輝，徐 強，林昌松

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）常見的并發癥[1]。隨著患者生命的延長，以及長期應用糖皮質激素、免疫抑制劑，骨質疏松癥（osteoporosis，OP）的發病率逐漸上升，嚴重影響患者生活質量，成為SLE的十大重要挑戰之一[2]。因此，臨床醫生應關注LN繼發的OP。前期臨床研究表明，脾腎陽虛證是LN繼發OP的常見證型。然而中醫證型缺乏客觀標志物，為尋找LN繼發OP脾腎陽虛證的生物標志物，本研究收集了LN繼發OP脾腎陽虛證、非脾腎陽虛證患者的血清，以及健康自愿者的血清，采用UPOC-QTOF-MS的代謝組學方法篩選、分析各組血清中的差異離子，通過商業化軟件Progenesis QI（version 2.2）和華大自主研發的代謝組學R軟件metaX對質譜數據進行統計分析，并基于數據庫KEGG進行代謝物鑒定、分析，最終得出LN繼發OP脾腎陽虛證的可能代謝標志物。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 診斷標準LN診斷參照2009年美國風濕病學會修訂的SLE分類診斷標準[3]，經腎活檢明確診斷為LN。OP的診斷標準參照《中國人骨質疏松癥建議診斷標準》（第3稿）[4]。脾腎陽虛證辨證標準參照《狼瘡腎炎的診斷、辨證分型及療效評定（試行方案）》中脾腎陽虛證的診斷標準[5]，主癥：面浮肢腫，甚至全身浮腫，畏寒肢冷，神疲乏力，腰膝酸冷。次癥：面色無華，便溏尿少，惡心嘔吐。舌脈：舌淡胖，苔白，脈沉細弱。符合2項主癥，或1項主癥，2項次癥，參考舌脈即可確定。

1.2 納入標準（1）符合LN、OP診斷標準，辨證為脾腎陽虛證（醫師要求具有主治醫師及以上職稱，以保證準確性）；（2）年齡18~60歲；（3）知情同意，自愿加入本研究。

1.3 排除標準（1）妊娠或哺乳期患者；（2）合并心、腦、造血系統等其他嚴重原發性疾病及精神病患者；（3）合并甲狀腺疾病、甲狀旁腺疾病、糖尿病、非骨質疏松性骨病、關節結核等；（4）嚴重感染等并發癥或已行透析治療的患者。

1.4 研究對象 本研究獲得廣州中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批號：NO.K〔2020〕068）。收集2019年6月至2020年1月在廣州中醫藥大學第一附屬醫院住院的LN繼發OP患者。依據中醫證型,將患者分為脾腎陽虛證LN繼發OP組（PSYX組）與非脾腎陽虛證LN繼發OP組（FPSYX組），并募集健康志愿者作為健康對照組（Health組）。

1.5 主要試劑與儀器 甲醇（Merck，批號：06035，規格：2.5L/瓶），甲酸（Dikma，批號：50144，規格：50 mL/瓶）；冷凍離心機（德國Eppendorf，型號：5430R），恒溫攪拌器（中國Biocomma，型號：BC1000），Waters 2D UPLC（英國Waters，型號：ACQUITY UPLCI-Class 2D），高分辨質譜儀（英國Waters，型號：Xevo G2-XS QTOF），ACQUITY UPLC BEH C18 column（英國Waters，型號：3173810125135），水液凈化系統（美國Millipore Corporation，型號：Milli-Q Integral），冷凍真空濃縮機（丹麥Labogene，型號：MaxiVacbeta），液相色譜儀（英國Waters，型號：2777C UPLC system）。

1.6 觀察指標 收集研究對象的一般資料，包括年齡、性別、病程、骨折病史、股骨頭壞死病史，以及糖皮質激素、免疫抑制劑、鈣劑、維生素D、雙膦酸鹽使用史；檢測腰椎及髖部骨密度；分析患者中醫證型。所有研究對象均在07：00:00空腹抽取靜脈血4 mL。置于肝素化的EP管中，離心10 min（10 000 g，4℃），分離上層血清，置于干凈的2 mL EP管中，儲存于-80℃冰箱中備檢。

1.7 檢測方法 代謝物提取、檢測方法步驟見圖1。

圖1 實驗流程圖

1.7.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC BEH C18column（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters，UK)進行色譜分離，色譜柱柱溫為50℃，流速為0.4 mL/min,其中A流動相為水和0.1%甲酸，B流動相為甲醇和0.1%甲酸。對代謝物采用以下梯度進行洗脫：0～2 min,100%流動相A；2～11 min，0%～100%流動相B；11～13 min，100%流動相B；13～15 min，0%～100%流動相A。每個樣本的上樣體積為5 μL。

1.7.2 質譜條件 利用高分辨串聯質譜Xevo G2-XS QTOF（Waters，UK）分別進行正負離子模式采集，從色譜柱上洗脫下來的小分子。正離子模式下，毛細管電壓和錐孔電壓分別為3.0 kV和40.0 V。負離子模式下，毛細管電壓及錐孔電壓分別為2.0 kV和40.0 V。采用MSE模式進行Centroid數據采集，一級掃描范圍為50～1 200 Da，掃描時間為0.2 s，對所有先驅離子按照20 eV到40 eV的能量進行碎裂，采集所有的碎片信息，掃描時間為0.2 s。在數據采集過程中，對LE信號每3 s進行實時質量校正。同時，每隔10個樣本進行一次混合后質控樣本的采集，用于評估在樣本采集過程中儀器狀態的穩定性。

1.8 數據分析及統計學方法 臨床數據分析采用SPSS 25.0統計軟件，計量資料采用“中位數（四分位間距）”[M（P25，P75）]表示。不符合正態分布的計量資料采用非參數檢驗，計數資料采用χ2檢驗。實驗數據使用軟件MassLynx4.1（Waters，UK）進行分析，峰提取主要通過商業軟件Progenesis QI（version 2.2）（來源：Thermo Fisher Scientific,USA）實現，包括峰對齊、峰提取、歸一化、去卷積和化合物鑒定等步驟。質量控制-局部多項式回歸擬合信號校正，得到的數據采用多變量PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值，結合單變量分析差異倍數（fold-change）和t檢驗的P值來篩選差異表達的代謝物。篩選條件[6]:（1）VIP≥1；（2）fold-change≥1.2或者≤0.8333；（3）P＜0.05。三者取交集，得到共有的離子即差異離子。代謝通路分析基于數據庫KEGG、HMDB。

代謝組學數據分析軟件metaX（版本：1.0.3，來源：Beijing Genomics Institute,CN）[7]，可進行單變量和多變量分析，從而獲得組間差異代謝物，組間比較采用t檢驗。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究對象基本情況 非脾腎陽虛證包括熱毒熾盛證1例，肝腎陰虛證3例，氣陰兩虛證2例。PSYX組與FPSYX組的各項臨床資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。3組均為女5人，男1人，在年齡、病程、骨折史、股骨頭壞死史方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。PSYX組、FPSYX組骨密度明顯低于Health組（P＜0.01）。（見表1）

表1 研究對象一般資料

2.2 質量控制結果 質量控制的離子流圖表明，儀器的穩定性良好。（見圖2）

圖2 QC樣本TIC重疊圖

2.3 單變量分析 采用t檢驗和變異倍數分析。在統計分析過程中，進一步統計檢驗得到P值。最終結果以火山圖形式呈現差異倍數（Fold change）和P值兩個指標，通常以差異倍數≥1.2或≤0.833 3，P＜0.05作為篩選差異代謝物的條件。結果表明FPSYX組與Health組的差異代謝物較多，而PSYX組與FPSYX組的差異代謝物明顯減少。（見圖3）。

圖3 組間比較單變量分析火山圖

2.4 多變量分析

2.4.1 主成分分析PCA主要用于觀察實驗模型中的組間分離趨勢，以及是否有異常點出現，同時從原始數據上反映組間和組內的變異度。結果表明FPSYX組的離散較大，說明該組受試者的代謝物差異較大，而PSYX組與Health組較集中。（見圖4）。

圖4 組間比較PCA模型圖

2.4.2 PLS-DA分析 使用metaX軟件建立每兩個組之間的PLS-DA模型，若模型參數（R2和Q2）值較高，則當前PLS-DA模型較為可靠，同時對該模型參數R2和Q2進行置換檢驗，次數為200次。組間兩兩比較結果表明，與Health組比較，PSYX組與FPSYX組的R2和Q2值均較高，代謝物差異較大。而與FPSYX組比較，PSYX組的R2和Q2值均較低，代謝物差異較小。（見圖5）3組間比較，R2和Q2值較高，代謝物差異較大。（見圖6）

圖5 組間兩兩比較的PLS-DA圖

圖6 3組間比較的PLS-DA圖

2.5 鑒定到的差異 生物標志物基于數據庫HMDB、KEGG分析，與FPSYX組、Health組比較，PSYX組的N-（1-甲基-6-苯基咪唑并[4，5-b]吡啶-2-基）羥胺、10-氧-11，15-植物二烯酸、2，3-二諾-8-異前列腺素上調，9，10-環氧十八碳三烯酸醚烯酸、烯二酸、脫鎂葉綠酸鹽A、根霉素b、磷酸-大麻素、16α-羥雌酮、2-羥雌酮、16-葡萄糖醛酸-雌三醇、1α，25雙羥維生素D3、反式-3-氯-2-丙烯-1-醇下調。這些差異代謝物與化學致癌作用，α-亞麻酸代謝，逆行內源性大麻素信號通路，激素的生物合成，氯代烷烴和氯代烯的降解等多個代謝通路相關。差異離子及鑒定結果見表2。

表2 鑒定的生物標志物及代謝通路

對篩選出來的差異離子進行聚類分析，用熱圖形式呈現。相對于整體水平，FPSYX組Phospho-anandamide水平升高，PSYX組trans-3-Chloro-2-propene-1-ol、1alpha,25-Dihydroxyvitamin D3、Rhizocticin B、Pheophorbide a、2-Hydroxyestrone水平降低。Health組2,3-Dinor-8-iso prostaglandin F1alpha水平降低，Pheophorbide a水平升高。（見圖7）

圖7 樣品生物標志物歸一化峰面積的熱圖和聚類圖

3 討 論

LN目前尚無對應的中醫病名，根據水腫、蛋白尿、管型尿、膿尿、少尿或無尿等主要臨床表現，LN可歸屬于中醫學中“水腫”“尿濁”“隆閉”“虛勞”等范疇。LN病因復雜，可分為內因、外因。內因主要是先天稟賦不足、后天失調、勞累過度或七情所傷，外因主要是外感風寒濕熱之邪，氣血、經絡不通，日久及腎。葉任高、孫偉均認為其病機以腎虛、瘀、熱、毒為主，其中以腎虛為本，與陰虛關系最為密切，瘀、熱、毒為標[8-9]。隨著疾病的發展，又變生出濕濁、溺毒等病理產物，日久可形成氣陰兩虛、脾腎氣（陽）虛等證候。陰虛、熱毒、濕熱、瘀血是本病的病機關鍵。

脾為后天之本，氣血生化之源；腎為先天之本，藏精主骨生髓，骨的生長發育依賴氣血、腎精的滋養。脾陽虛，則水谷精微化生不足，腎陽不足，精不化氣，則導致骨骼失養，骨枯不榮，發為“骨痿”，即OP的發生。陳喆[10]采用補脾益腎法治療脾腎陽虛證骨質疏松癥患者，發現不僅可以改善癥狀，而且可以提高骨密度，從而證實了脾腎陽虛是OP的重要病機。

本研究是在前期LN繼發OP相關證候臨床研究的基礎上進一步開展的研究。本團隊前期統計了66例LN繼發OP患者的中醫證型，脾腎陽虛證占83.33%（55/66）。

本研究通過高通量代謝組學分析LN繼發OP脾腎陽虛證的生物標志物，發現了多種內源性代謝物質發生改變，涉及激素合成、代謝物降解等多個通路，與炎癥、損傷、免疫紊亂、骨細胞及骨代謝異常、腸道菌群失調有關，揭示了LN繼發OP脾腎陽虛證可能的物質基礎。

N-（1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶-2-基）羥胺，即PhIP，是一種致癌雜環芳香胺，對心、肺、肝、腎蛋白質有氧化損傷[11]和化學致癌作用[12]。α-亞麻酸攝入量與骨密度呈正相關[13]，在人體內還可發揮抗炎、調節免疫的作用[14]。反式-3-氯-2-丙烯-1-醇屬于氯代烷烴和氯代烯的降解物質，與菌群調節有密切關系[15-16]。研究提示PSYX組患者該物質明顯上調，可引起腎損傷，導致腎性骨病；α-亞麻酸下調，降低骨密度，導致炎癥、免疫失調。PhIP屬“濁物”，應排泄出去，而α-亞麻酸屬于“精微物質”，應吸收。反式-3-氯-2-丙烯-1-醇可理解為“脾氣”“脾陽”的功能反應。因脾陽虛，“升清降濁”功能下降，導致清者不升，濁者不降。因此，PhIP上調，α-亞麻酸、反式-3-氯-2-丙烯-1-醇下調可能是脾陽虛衰的生物標志物。2,3-二諾-8-異前列腺素是花生四烯酸代謝通路中重要的炎癥介質，有促進或抑制骨與軟骨代謝的作用[17]。ZHANG A H等[18]應用UPLC/MS方法探討了去卵巢骨質疏松大鼠的生物標志物，發現花生四烯酸代謝等10種生物標志物顯著上調。脫鎂葉綠酸A是卟啉的衍生物，其和紫紅素18的氯素大環可結合重組RANKL，抑制RANK-RANKL相互作用，抑制RANKL依賴的模型細胞激活和RANK表達前體向破骨細胞分化[19]，從而起到抗骨質疏松的作用。本研究提示，脾腎陽虛證和非脾腎陽虛證LN繼發OP患者，2,3-二諾-8-異前列腺素明顯上調，脫鎂葉綠酸A顯著下調，提示這2種物質可能是LN繼發OP的重要生物標志物。

雌激素（16α-羥雌酮、2-羥雌酮、16-葡萄糖醛酸-雌三醇）及1α,25雙羥維生素D3在骨代謝中扮演重要角色。2-羥雌酮、16α-羥雌酮、雌三醇均可增加骨量，提高骨密度，防止骨質疏松的發生[20-22]。1α,25雙羥維生素D3是人體所必需的活性維生素D3，可通過調節鈣磷代謝，促進成骨樣細胞活性和骨形成蛋白合成，調節OPG、RANKL的表達[23]，從而提高骨密度。雌激素、1α，25雙羥維生素D3的作用與中醫學中“天癸”“腎氣”的作用相似，均為腎所主。研究提示PSYX組的上述激素水平明顯下調，考慮與腎陽虛衰有密切關系，可能是腎陽虛的生物標志物。楊新軍[24]發現絕經后脾腎陽虛證OP患者血清25-OHD3水平顯著降低，與本研究較一致。

本研究屬非靶向高通量代謝組學分析，所檢測出的離子眾多，雖經不斷篩選、對比鑒定、分析，但只能判定潛在分子標志物，尚需靶向分析驗證。此外，本研究結果也存在大量無法分析的分子，具體通路和作用無法得知。由于本研究的樣本量小，未必能代表整體，下一步將擴大檢測樣本量，減小偏倚。