BRAF V600E突變與甲狀腺乳頭狀癌侵襲性及超聲特征的相關(guān)性研究

趙美麗，張文婷，常 雋，陳松旺，邵國(guó)強(qiáng)

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）功能檢查科，江蘇 南京 210006；

2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）核醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210006

近年來(lái)甲狀腺癌的發(fā)病率越來(lái)越高，30年間甲狀腺癌的發(fā)病率已升高近3倍［1］，新增的甲狀腺癌中90%以上為甲狀腺乳頭狀癌（papillary carcinoma of thyroid，PTC）［2］。部分甲狀腺微小乳頭狀癌為惰性癌［3］，處于低風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)［4］。PTC術(shù)后10年生存率能達(dá)到80%～90%，但仍有5%～30%的患者易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和短期內(nèi)復(fù)發(fā)［5］。BRAFV600E突變是甲狀腺癌中最常見(jiàn)的一種基因突變形式，但關(guān)于BRAFV600E突變對(duì)PTC侵襲性價(jià)值及與超聲特征的相關(guān)性尚存爭(zhēng)議。本研究旨在探討B(tài)RAFV600E突變?cè)谂袛郟TC侵襲性方面的價(jià)值及與甲狀腺癌結(jié)節(jié)超聲特征的相關(guān)性，完善BRAFV600E突變檢測(cè)在PTC管理中的應(yīng)用，更好地為臨床診治PTC提供參考。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年1月—2020年3月術(shù)前行常規(guī)超聲檢查、超聲引導(dǎo)下細(xì)針抽吸細(xì)胞學(xué)檢查（fineneedle aspiration biopsy，F(xiàn)NAC）及BRAFV600E檢測(cè)，并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為PTC的患者174例，將其分為突變組151例和無(wú)突變組23例，其中男性33例，女性141例，年齡23～75歲，平均年齡（45.2±11.3）歲。

研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：① 甲狀腺細(xì)胞病理學(xué)Bethesda報(bào)告系統(tǒng)（The Bethesda System for Reporting Thyroid Cytopathology，TBSRTC）陽(yáng)性；② TBSRTC陰性、不能確診而B(niǎo)RAFV600E檢測(cè)陽(yáng)性者；③ 術(shù)后病理學(xué)檢查、超聲、TBSRTC及BRAFV600E檢測(cè)資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除上述資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與方法

1.2.1 常規(guī)超聲檢查方法

采用德國(guó)Siemens公司的Acuson Oxana 2彩色超聲診斷儀，線陣探頭頻率為5～12 MHz，患者取仰臥位，進(jìn)行甲狀腺常規(guī)超聲檢查，記錄可疑甲狀腺癌結(jié)節(jié)位置、最大徑、回聲、邊界、形態(tài)、縱橫比、鈣化、血流、后方衰減等超聲特征。

1.2.2 超聲特征描述要點(diǎn)

觀察并記錄甲狀腺癌結(jié)節(jié)位置（按照結(jié)節(jié)位于甲狀腺左或右葉上中下部，峽部，結(jié)節(jié)邊緣是否貼近前后包膜、頸動(dòng)脈、氣管進(jìn)行描述）、最大徑、回聲、邊界、形態(tài)、縱橫比（橫斷面測(cè)量縱徑/橫徑）、鈣化［6］（點(diǎn)狀鈣化及≥2 mm的粗大鈣化）、血流（有，無(wú)）、衰減等聲像圖特點(diǎn)。

1.2.3 US-FNAC取材方法

由具有豐富穿刺經(jīng)驗(yàn)的主治及以上醫(yī)師進(jìn)行穿刺操作。患者取仰臥位，充分暴露頸部，使用5 mL注射器連接7號(hào)穿刺針頭，抽吸針管內(nèi)0.5 mL負(fù)壓，超聲引導(dǎo)下對(duì)目標(biāo)結(jié)節(jié)進(jìn)行穿刺，每個(gè)結(jié)節(jié)穿刺3針，針頭進(jìn)入目標(biāo)結(jié)節(jié)后在不同方向抽吸10～15次，當(dāng)抽吸物到達(dá)針頭與注射器銜接處時(shí)退針，前2針將抽取物注于載玻片上，推片后放入95%乙醇中濕固定后送病理科檢查，行H-E染色，鏡下觀察。第3針抽取物注入裝有基因保存液的瓶?jī)?nèi)，行BRAFV600E檢測(cè)。

1.2.4 細(xì)胞學(xué)病理結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)

參照TBSRTC 6分類標(biāo)準(zhǔn)［7］分為：Ⅰ類，標(biāo)本無(wú)法診斷或不滿意；Ⅱ類，良性病變；Ⅲ類，意義不明確的非典型病變或意義不明確的濾泡性病變；Ⅳ類，濾泡性腫瘤或可疑濾泡性腫瘤；Ⅴ類，可疑惡性腫瘤；Ⅵ類，惡性腫瘤。Ⅱ類記作陰性，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ類記作陽(yáng)性，Ⅰ、Ⅲ類記作無(wú)法確診。

1.2.5BRAFV600E基因突變檢測(cè)方法

采用FFPE樣本DNA分離試劑盒（廈門(mén)艾德生物科技醫(yī)藥有限公司，ADx-FF01）提取組織中的DNA，BRAFV600E點(diǎn)突變采用人類BRAF基因V600E突變檢測(cè)試劑盒（廈門(mén)艾德生物科技醫(yī)藥有限公司，ADxBR01）提供的擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法進(jìn)行檢測(cè)，均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作。BRAFV600E點(diǎn)突變判讀標(biāo)準(zhǔn)：若樣本的Ct值＜28認(rèn)為存在點(diǎn)突變，否則為未突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；各指標(biāo)對(duì)BRAFV600E突變的影響采用二元logistic回歸分析。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TBSRTC、BRAF V600E突變及術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì)

術(shù)后病理學(xué)檢查確診的PTC共174例，TBSRTC陽(yáng)性158例，陰性11例，不能確診5例，診斷準(zhǔn)確度90.80%（158/174）。BRAFV600E突變151例，無(wú)突變23例，突變率86.78%（151/174）。TBSRTC檢測(cè)11例陰性及5例不能確診患者均發(fā)生了BRAFV600E突變，術(shù)后病理學(xué)檢查亦證實(shí)其為PTC。

2.2 BRAF V600E突變與各臨床病理學(xué)及超聲特征比較

突變組與無(wú)突變組比較顯示，BRAFV600E突變與各臨床病理學(xué)特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）；與部分超聲特征（位置、結(jié)節(jié)最大徑、鈣化、后方衰減）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明這4個(gè)超聲特征與BRAFV600E突變有一定相關(guān)性，結(jié)節(jié)最大徑≤5 mm、無(wú)鈣化、后方無(wú)衰減、貼近前包膜的結(jié)節(jié)BRAFV600E突變概率較大（表2、3）。

表1 兩組各臨床病理學(xué)特征比較n（%）

表2 兩組超聲位置特征比較n（%）

表3 兩組其他超聲特征比較n（%）

2.3 二元logistic回歸分析結(jié)果

二元logistic回歸分析表明，只有結(jié)節(jié)的鈣化及位置是與BRAFV600E突變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，無(wú)鈣化或貼近前包膜PTC結(jié)節(jié)更易發(fā)生BRAFV600E突變，無(wú)鈣化結(jié)節(jié)發(fā)生突變的概率是有鈣化結(jié)節(jié)的4.176倍，貼近前包膜結(jié)節(jié)發(fā)生突變的概率是不貼近前包膜結(jié)節(jié)的4.844倍（表4）。

表4 二元logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

BRAFV600E是最常見(jiàn)的一種與甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的變異基因，對(duì)于其引起PTC的機(jī)制較普遍的認(rèn)識(shí)是通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路來(lái)促進(jìn)細(xì)胞不斷增殖進(jìn)而腫瘤發(fā)生［8］。

既往研究［9］發(fā)現(xiàn)，PTC患者BRAFV600E突變率為89.6%，特異度100.0%。本研究結(jié)果與之相近（突變率86.8%），突變率較高的原因可能與取材及檢測(cè)技術(shù)逐漸成熟相關(guān)。

國(guó)內(nèi)外對(duì)BRAFV600E突變?cè)赑TC侵襲性中的價(jià)值存在較多爭(zhēng)議。Huang等［10］及Kombak等［11］研究發(fā)現(xiàn)，BRAFV600E突變與病理學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較高的T分期、腫瘤包膜不完整或缺失等侵襲性指標(biāo)相關(guān)。而Czarniecka等［12］對(duì)258例PTC（結(jié)節(jié)最大徑＞1 cm）研究顯示，BRAFV600E突變狀態(tài)與任何臨床病理預(yù)后因素均不相關(guān)。Han等［13］也認(rèn)為BRAFV600E突變不是頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。本組資料顯示，BRAFV600E突變與未突變組在各臨床病理學(xué)特征間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明單獨(dú)檢測(cè)BRAFV600E突變并不能判斷PTC的侵襲性。從BRAFV600E突變率（86.78%）與PTC侵襲性指標(biāo)（頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率42.53%及突破包膜發(fā)生率14.37%）來(lái)看，二者發(fā)生率相差較大，前者亦不能預(yù)判后者。Mitsutake等［14］研究顯示，發(fā)生BRAFV600E突變的甲狀腺癌結(jié)節(jié)最大徑小于未突變的甲狀腺癌結(jié)節(jié)，且預(yù)計(jì)這部分發(fā)生BRAFV600E突變的甲狀腺癌可能有良好的預(yù)后，故反向預(yù)測(cè)（BRAFV600E突變預(yù)測(cè)PTC弱侵襲性）存在一定可能性。分析各研究得出不同結(jié)論的原因，可能與研究方案設(shè)計(jì)不同、樣本選取及所含數(shù)量差異、流行病學(xué)因素、甲狀腺癌不同病理學(xué)亞型差異等有關(guān)。

對(duì)BRAFV600E突變與各超聲特征間的關(guān)系研究較少，得出的結(jié)論也存在明顯爭(zhēng)議。Park等［15］的研究顯示，BRAFV600E突變與各超聲特征未見(jiàn)明顯相關(guān)性。溫泉等［16］的研究顯示，僅腺體內(nèi)多發(fā)病灶是BRAFV600E基因突變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而且鈣化結(jié)節(jié)更易出現(xiàn)BRAFV600E突變。本組資料結(jié)果顯示，只有PTC結(jié)節(jié)的鈣化與位置是BRAFV600E突變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且無(wú)鈣化者及貼近前包膜結(jié)節(jié)更易BRAFV600E突變，與溫泉等［16］研究得出的結(jié)論不同。分析原因，可能與選擇的統(tǒng)計(jì)因素及判斷標(biāo)準(zhǔn)不同相關(guān)。本研究中PTC結(jié)節(jié)是否多灶以術(shù)后病理學(xué)檢查結(jié)果判定為準(zhǔn)，顯示多灶與BRAFV600E突變無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，與既往多個(gè)學(xué)者［17-18］得出的結(jié)論相似，而溫泉等［16］學(xué)者是以超聲結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)判斷PTC的單灶與多灶，與本研究所選的判斷標(biāo)準(zhǔn)有所差異。對(duì)于PTC結(jié)節(jié)鈣化對(duì)BRAFV600E突變的影響與溫泉等［16］學(xué)者結(jié)論也不一致，本研究PTC鈣化結(jié)節(jié)統(tǒng)計(jì)包括了所有鈣化（微鈣化及粗大鈣化），而后者鈣化統(tǒng)計(jì)僅包含微鈣化患者。

既往研究顯示，不同部位的PTC其侵襲性不同［19］，有鈣化的PTC結(jié)節(jié)更易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［20］。本組資料顯示，貼近前包膜及無(wú)鈣化的PTC結(jié)節(jié)更易發(fā)生BRAFV600E突變，BRAFV600E突變與PTC弱侵襲性相關(guān)存在一定可能性，故推測(cè)超聲顯示貼近前包膜及無(wú)鈣化的PTC結(jié)節(jié)侵襲性較弱存在一定可能性。

本研究的不足之處：① 本組PTC患者僅進(jìn)行了單一的BRAFV600E突變檢測(cè)，未與其他基因聯(lián)合檢測(cè)來(lái)進(jìn)一步判斷其在侵襲性方面的價(jià)值。② 未對(duì)PTC結(jié)節(jié)具體位置與侵襲性指標(biāo)間的關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)具有易發(fā)生BRAFV600E突變的超聲征象PTC結(jié)節(jié)的弱侵襲性未能直接證實(shí)，今后將對(duì)上述兩個(gè)方面進(jìn)行研究。

綜上所述，單獨(dú)的BRAFV600E突變與PTC侵襲性特征無(wú)明顯相關(guān)性，故術(shù)前超聲引導(dǎo)下FNAC標(biāo)本單獨(dú)檢測(cè)BRAFV600E突變并不能預(yù)判其侵襲性。超聲聲像圖特征中，無(wú)鈣化及貼近前包膜的可疑PTC結(jié)節(jié)更易發(fā)生BRAFV600E突變，推測(cè)其存在侵襲性較弱的可能。