阿帕替尼通過ERK/JAK2-STAT3途徑對MDA-MB-468荷瘤動物模型腫瘤細胞生長抑制和凋亡的影響及其作用機制探討

佟 玲，李義慧，李 佳，王建功（.唐山市人民醫院藥劑科，河北 唐山 06000；.唐山市人民醫院腫瘤綜合治療科，河北 唐山06000；.唐山市人民醫院放化一科，河北 唐山 06000）

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌的一種類型，具有較高的復發性和轉移性[1]，而血管生成對腫瘤的發展和轉移至關重要，血管生成主要由通過血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）誘導[2]。阿帕替尼（apatinib，APA）是一種口服的小分子抗血管生成靶向藥物，其可以通過與VEGFR-2結合并抑制其功能，在我國阿帕替尼已經被批準用于晚期胃癌的治療[3]，其在乳腺癌中的應用正在進行臨床試驗，一項Ⅱ期臨床研究結果顯示大劑量阿帕替尼對于TNBC具有一定的治療效果[4]。一項體外研究顯示阿帕替尼可以抑制TNBC細胞的增殖和遷移[5]，但是關于阿帕替尼在TNBC中的作用和機制尚不明確。有體內研究顯示阿帕替尼可通過抑制ERK/JAK2-STAT3抑制食管癌的進展[6]。本文旨在探討阿帕替尼通過ERK/JAK2-STAT3途徑對TNBC的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人TNBC細胞系MDA-MB-468細胞株（中國醫學科學院上海細胞庫）。BALB/c裸鼠（雌性，4 ～ 5周齡，SPF級，南京金陵醫院）。DMEM培養基血清和抗體（美國Invitrogen公司）。阿帕替尼（美國MCE公司）。逆轉錄cDNA試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR試劑盒（瑞士Roche公司）。anti-VEGFR-2、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-JAK2、anti-STAT3、anti-p-STAT3（美國Abcam公司）。PVDF膜（美國Bio-Rad公司）。TUNEL凋亡染色試劑盒。倒置顯微鏡（日本Olympus IX71）。

1.2 荷瘤裸鼠模型建立、分組及干預方法

將MDA-MB-468細胞在DMEM培養基中培養，然后將處于對數生長期的MDA-MB-468細胞消化、洗滌、重懸細胞（密度為1×107個·mL-1）。將0.2 mL的細胞懸液注射在腋下。每日觀察腫瘤生成情況，在建模14 d時經過測量和計算腫瘤體積大于60 mm3提示建模成功。

選擇18只建模成功的小鼠分為3組（n= 6）：對照組、低劑量APA組（4.15 mg·kg-1，qd，灌胃）和高劑量APA組（8.30 mg·kg-1，qd，灌胃）[7]。對照組小鼠使用等量的生理鹽水灌胃，qd，連續14 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 腫瘤體積和質量 在干預后第14 d通過頸脫臼處死小鼠，取出腫瘤組織，擦干體液后測量腫瘤體積和質量，計算抑瘤率。

1.3.2 TUNEL染色檢測凋亡 將腫瘤組織固定后透化，根據試劑盒說明書進行操作，分別進行TUNEL染色和細胞核染色，然后進行封片。其中細胞核被染為藍色，棕色為TUNEL陽性細胞，提示凋亡，并計算凋亡率。

1.3.3 免疫組化染色檢測Ki-67 將腫瘤組織用甲醛固定、石蠟包埋，切片后進行脫石蠟、水合以及抑制內源性過氧化物酶活性處理。封閉切片并在4 ℃下加入Bcl-2抗體孵育過夜，然后按照試劑盒說明書加入二抗進行顯色。通過觀察Ki-67的染色情況分析增殖情況。通過半定量法分析Ki-67的染色強度。

1.3.4 Western blot檢測蛋白 將腫瘤組織裂解后收集總蛋白，通過BCA法測定蛋白量。每組樣品取30 μg蛋白在120 V/90 min條件下進行SDS-PAGE電泳，然后將分離的蛋白轉移到PVDF膜上并加入5%脫脂牛奶作為封閉溶液。分別將anti-VEGFR-2、anti-ERK、anti-p-ERK、anti-JAK2、anti-STAT3、anti-p-STAT3稀釋500倍，然后分別加入PVDF膜孵育過夜（< 4 ℃），加入HRP偶聯二抗（1∶5000稀釋）在室溫下孵育1 h。ECL對蛋白進行可視化處理。

1.4 統計學處理

使用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料以均值±標準差表示，計數資料使用“%”表示，進行單因素方差分析，P< 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 建模情況概述

本次研究中共使用20只小鼠建立荷瘤模型，其中18只小鼠腫瘤體積大于60 mm3，建模成功率為90.00%。

2.2 阿帕替尼對TNBC荷瘤裸鼠模型的腫瘤抑制作用

通過對各組腫瘤體積、質量進行比較，發現低劑量APA組、高劑量APA組的腫瘤體積和質量均低于對照組，差異具有統計學意義（P< 0.05）；且高劑量APA組的腫瘤體積和質量顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。詳見表1。

表1 各組腫瘤體積、質量和抑瘤率比較. n = 6Tab 1 Comparison of tumor volume, quality and tumor inhibition rate in each group. n = 6

2.3 阿帕替尼對TNBC荷瘤裸鼠模型中腫瘤細胞凋亡的影響

干預后低劑量A PA組腫瘤細胞凋亡率為（17.34±2.68）%，高劑量APA組為（24.52±3.27）%，均高于對照組的（3.16±0.58）%，差異具有統計學意義（P< 0.05）；且高劑量APA組的凋亡率顯著高于低劑量APA組（P< 0.05）。

2.4 各組增殖情況比較

干預后低劑量APA組的Ki-67染色評分為（6.34±1.58）分、高劑量APA組為（4.63±1.26）分，低于對照組的（8.82±1.85）分，差異具有統計學意義（P< 0.05）；且高劑量APA組的Ki-67染色評分顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。

2.5 各組VEGFR-2和ERK通路水平比較

干預后低劑量APA組與高劑量組的VEGFR-2蛋白表達水平和ERK蛋白磷酸化水平均低于對照組（P< 0.05）；且高劑量APA組的VEGFR-2蛋白表達水平顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。詳見表2。

表2 各組VEGFR-2蛋白表達水平和ERK蛋白磷酸化水平比較. n = 6Tab 2 Comparison of VEGFR-2 protein expression level and ERK protein phosphorylation level in each group. n = 6

2.6 各組JAK2-STAT3通路水平比較

干預后低劑量APA組與高劑量APA組的JAK2-STAT3蛋白表達水平均低于對照組（P< 0.05）；且高劑量APA組的JAK2-STAT3蛋白表達水平顯著低于低劑量APA組（P< 0.05）。詳見表3。

表3 各組JAK2-STAT3通路水平比較Tab 3 Comparison of JAK2-STAT3 pathway level in each group

3 討論

TNBC的發病率占乳腺癌總數的17% ～ 20%[7]。現階段治療TNBC的主要方法包括手術治療、化學療法和放射療法，其中化學療法是最常用的治療方法之一，但仍有部分患者預后不佳。近年來，抗血管生成藥物在乳腺癌的治療中取得了一定進展，臨床研究發現阿帕替尼對晚期乳腺癌具有一定的療效，且不良反應可控，但其在TNBC中的作用仍需要進一步研究[8]。小分子激酶抑制劑的發現進一步提高了對腫瘤的治療效果，阿帕替尼是我國首個自主研發的口服藥物，其在晚期胃癌中具有顯著療效[9]，與抗血管生成藥物貝伐珠單抗比較，阿帕替尼具有經濟、安全性高的特點[10]，最新的研究也顯示其在乳腺癌中也有較好的作用[11-13]。本文通過皮下注射TNBC細胞系MDA-MB-468構建荷瘤裸鼠模型，分別使用不同劑量的阿帕替尼灌胃，發現高劑量APA組抑瘤率為（31.37±1.95）%，顯著高于低劑量APA組，阿帕替尼促進腫瘤細胞凋亡和抑制增殖的能力具有劑量依賴性。有研究[14]顯示阿帕替尼聯合常規化療可有效治療TNBC，其效果和安全性良好。Li等[15]研究結果顯示阿帕替尼聯合卡培他濱對于晚期TNBC具有較好的治療效果，提示阿帕替尼對于TNBC具有較好的控制作用。

VEGFR-2是促進血管和淋巴管生成的重要細胞因子，阿帕替尼的抗腫瘤活性通過抑制VEGFR-2從而抑制TNBC進展[16]。研究[17]顯示VEGFR-2可以通過促進ERK通路促進腫瘤細胞的增殖。本次研究結果顯示阿帕替尼可劑量依賴性的抑制TNBC荷瘤裸鼠模型腫瘤組織中的VEGFR-2、ERK通路和JAK-STAT通路。有研究顯示阿帕替尼可以通過抑制ERK通路抑制膽管癌細胞的增殖、遷移和侵襲[18]。Liu等[19]研究結果也顯示阿帕替尼可通過抑制ERK通路提高肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。Guo等[20]發現在胃癌中，阿帕替尼耐藥性的出現與JAK-STAT通路的激活有關。Ding等[21]研究結果顯示阿帕替尼可通過抑制JAKSTAT通路抑制卵巢癌上皮細胞的上皮-間充質轉化。以上研究提示阿帕替尼可抑制TNBC中的ERK和JAK-STAT通路。

綜上所述，本研究結果顯示阿帕替尼可通過抑制ERK和JAK-STAT通路抑制TNBC荷瘤裸鼠模型的腫瘤生長并促進腫瘤細胞凋亡，但關于阿帕替尼治療TNBC的療效、安全性和機制仍有待進一步研究。