疏肝理脾湯對(duì)非酒精性脂肪性肝炎大鼠腸道菌群多樣性和豐富度的影響*

王 雅，代 靜，劉先姜，張 濤

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在我國(guó)慢性肝病疾病譜中的占比逐年增長(zhǎng)[1]。非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）屬于NAFLD一部分，是在單純非酒精性脂肪肝輕度脂肪病變基礎(chǔ)上發(fā)生炎癥反應(yīng)的一類疾病，增加了終末期肝病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[2]。近年多項(xiàng)研究證實(shí)腸道微生物可影響腸道固有層免疫細(xì)胞，而其通過(guò)免疫識(shí)別受體作用肝細(xì)胞，導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng)。修復(fù)腸道免疫屏障功能，恢復(fù)其屏障功能以減輕肝臟炎癥反應(yīng)，能阻斷NAFLD向NASH進(jìn)展[3]，“菌-腸-肝”軸理論的提出為防治NASH的發(fā)生、發(fā)展提供理了論基礎(chǔ)[4]。疏肝理脾湯源于柴芍六君子湯，有改善肝臟炎癥、纖維化的療效[5]，但尚無(wú)關(guān)于其對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)方面的研究。因此，本研究以“菌-腸-肝”理論為依據(jù)，運(yùn)用16srRNA高通量測(cè)序法，觀察疏肝理脾湯對(duì)NASH大鼠腸道菌群的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡健康、成年SPF級(jí)雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量（180±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本次研究經(jīng)過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批件號(hào)：SYFY20170225，依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 飼料 蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飼料配方：L-氨基酸175.7 g/kg，玉蜀黍淀粉150.0 g/kg，右旋麥芽糖50.0 g/kg，玉米油100.0 g/kg，纖維素30.0 g/kg，碳酸氫鈉7.4 g/kg，維生素混合物10.0 g/kg，鹽混合物35.0 g/kg。

1.3 藥物與試劑 疏肝理脾湯（方藥組成：柴胡15 g，茯苓15 g，白芍15 g，白術(shù)10 g，砂仁5 g，甘草5 g）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。傳統(tǒng)中藥法煎制，水浴濃縮至生藥含量為2.0 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

糞便DNA小量提取試劑盒（美國(guó)Omega公司，批號(hào)：20190703）；AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（美國(guó)AXYGEN公司，批號(hào)：20150606）；完全福氏佐劑F5881（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：9007-81-2）；不完全福氏佐劑F5506（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLBL9742V）。

1.4 主要儀器QuantiFluorTM ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（美國(guó)Promega公司）；UC-7超薄切片機(jī)（德國(guó)萊卡公司）；透射電鏡HT7700（日本日立高新技術(shù)公司）；電子顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.5 造模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周大鼠，從56只大鼠中隨機(jī)選取8只作為正常對(duì)照組，剩余48只大鼠采用蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食聯(lián)合慢性束縛應(yīng)激刺激法復(fù)制NASH大鼠模型：造模大鼠給予蛋氨酸膽堿缺乏（MCD）飲食，每天投食量為10 g/100 g，每天飲水量為12 mL/100 g。參照國(guó)內(nèi)肝郁脾虛證動(dòng)物模型通行方法，給予饑飽失常飲食[6-7]，即第1天給予常規(guī)量MCD飲食，第2天禁食，均不禁水，同時(shí)給予慢性束縛應(yīng)激刺激，即每日將小鼠放置于束縛制動(dòng)筒內(nèi)限制活動(dòng)4 h，束縛開(kāi)始時(shí)間不固定，同時(shí)保持束縛期間禁食、禁水。各大鼠每周稱體質(zhì)量，依照體質(zhì)量調(diào)整投食量和飲水量。5周后，觀察各組大鼠進(jìn)食、飲水、行為、活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)及二便等情況，正常對(duì)照組與造模組分別隨機(jī)抽取2只大鼠行肝臟病理切片檢測(cè)，評(píng)判造模結(jié)果。將剩余46只造模成功大鼠依照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組（15只）、疏肝理脾低劑量組（16只）、疏肝理脾高劑量組（15只）。

1.6 實(shí)驗(yàn)給藥 給藥期間所有大鼠均給予正常飲食。參照陳奇主編《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算給藥量，折算后疏肝理脾高、低劑量組大鼠生藥灌胃量分別為6.18、1.78 g/kg，灌胃體積為10 mL/kg；模型組和正常對(duì)照組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水，均于每天14:30:00灌胃給藥，1次/d，連續(xù)給藥4周。末次給藥后12 h禁食，稱重，按體質(zhì)量予以10%水合氯醛，0.35 mL/100 g標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉。

1.7 觀察指標(biāo) 給藥第4周末，每組選取6只大鼠采集約1 g新鮮糞便，放入EP管中-80℃低溫冰箱保存固定，進(jìn)行16srRNA腸道菌群多樣性檢測(cè)。操作人員予D4015提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。ABI GeneAmp 9700，TransGen AP221-02型儀按指定測(cè)序區(qū)域，合成barcode的特異引物。采用2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)PCR混合產(chǎn)物，切膠回收PCR產(chǎn)物（AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司），進(jìn)行Tris_HCI洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。引物序列號(hào)為338F ACTCC TACGGGAGGCAGCAG；806R GGA CTACHVGGGTWTCTAAT，參照電泳初步定量結(jié)果，運(yùn)用QuantiFluortTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)檢測(cè)定量，而后予Miseq測(cè)序，分析腸道菌群16srRNA多樣性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 首先對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾得到有效數(shù)據(jù)，保證OTU（operational taxonomic units）聚類及后續(xù)分析的準(zhǔn)確性，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU聚類/去噪和物種分類分析，形成OTU和其他物種分類等級(jí)的物種豐度譜。基于數(shù)據(jù)均一化后的OTU物種豐度譜，再對(duì)OTU進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，并對(duì)物種注釋在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。Kruskal Wallis和ANOVA的分析運(yùn)用qiime1 group_significance.py腳本，ANCOM的分析運(yùn)用qiime2 composition ancom命令。ANCOM、Kruskal Wallis和ANOVA用于多組間豐度差異的顯著性檢驗(yàn)。Kruskal Wallis和ANOVA提供檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量（Test-Statistic），總的P值（P），校正錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率P值（FDR_P），Bonferroni校正P值（Bonferroni_P），以及各分組均值，但不提供多重比較的結(jié)果；ANOVA是參數(shù)檢驗(yàn)，要求豐度服從正態(tài)分布，而大部分物種的豐度都是不服從正態(tài)分布的；Kruskal Wallis屬于非參數(shù)檢驗(yàn)，對(duì)分布沒(méi)有要求，較為適合菌群分析。LEfSe方法是非參數(shù)檢驗(yàn)和線性判別分析的結(jié)合，適合菌群豐度差異檢驗(yàn)。以上均采用R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)V4.0.1版統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 造模評(píng)價(jià)5周后，正常對(duì)照組大鼠毛發(fā)光澤，正常作息，飲食量及情緒無(wú)明顯變化；造模組大鼠毛發(fā)晦暗，無(wú)光澤，前期表現(xiàn)極度易激惹，后期表現(xiàn)情緒低落，倦怠少運(yùn)動(dòng)，飲食量減少，大便稀溏等類似中醫(yī)肝郁脾虛證之象。

光鏡下正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞漿清透，大小一致，肝竇清晰；造模組可見(jiàn)彌漫性、大泡性脂肪變性及氣球樣變，腺泡內(nèi)可見(jiàn)明顯點(diǎn)、灶狀壞死，散在可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示造模成功（見(jiàn)圖1）。

圖1 大鼠肝臟組織病理檢測(cè)（HE，×100）

2.2 腸道菌群測(cè)序序列分析、OUTs分析結(jié)果 共24份糞便樣本采得3 276 796條序列，樣本序列共測(cè)得數(shù)值計(jì)3 276 796，采得樣本中最大序列數(shù)為90 623，最小序列數(shù)為35 102，平均序列數(shù)共計(jì)45 511.05。

2.3 大鼠腸道菌群OUTs分析結(jié)果 對(duì)所有樣品進(jìn)行樣品物種組成及多樣性信息分析。依照界水平（Kingdom）、門水平（Phylum）、綱水平（Class）、目水平（Order）、科水平（Family）、屬水平（Genus）、種水平（Species）對(duì)所有樣本通過(guò)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行OTU絕對(duì)豐度信息聚類分析。對(duì)每個(gè)樣品在界門綱目科屬種7個(gè)分類水平上的序列數(shù)目占總序列數(shù)的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，可以有效地評(píng)估樣本的物種注釋分辨率（注釋到屬/種的比例越高表示樣本的OTU注釋效果越好），圖2展示了每個(gè)樣本中OTU在各分類水平注釋的相對(duì)程度。因注釋到種水平的物種數(shù)量少，本研究主要對(duì)注釋到門水平及屬水平的物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。大鼠肝臟組織病理檢測(cè)已證實(shí)此實(shí)驗(yàn)造模是成功的，兩兩比較結(jié)果表明，模型組與疏肝理脾低劑量組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而疏肝理脾高劑量組與疏肝理脾低劑量組間存在一定差異，但差異不顯著。而模型組與疏肝理脾高劑量組間在門水平上優(yōu)勢(shì)菌分別為厚壁桿菌、擬桿菌、變形菌和放線菌。門水平上兩組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組與疏肝理脾高劑量組在屬水平共得到75個(gè)屬，豐度最高18個(gè)物屬分別為乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、示波螺旋藻屬、瘤胃球菌屬1、普氏菌屬1、未特指的毛螺菌科屬、普氏菌屬、梭菌屬、布勞特化菌屬、類桿菌屬、未特指的梭菌科屬、未特指的梭菌屬、未特指的類桿菌屬、未特指的瘤胃球菌科屬、未特指的消化鏈球菌科屬、異桿菌屬、未指定的腸桿菌科屬、其他等。在模型組和疏肝理脾高劑量組，這18個(gè)菌群占了所有菌群豐度的82.2%和90.1%以上。與模型組比較，乳酸球菌屬、考拉桿菌屬、脫鹵桿菌屬、羅氏菌屬、黏液桿菌屬、葡萄球菌屬、氣球菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、昆蟲(chóng)腸道菌屬、SMB53、瘤胃球菌屬、費(fèi)氏刺骨魚(yú)菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬、未指明的梭菌科屬、霍爾德曼菌屬、“A”凝聚桿菌屬、小克里斯滕森氏菌等18種菌屬等僅在疏肝理脾高劑量組被檢測(cè)到，為疏肝理脾高劑量組所特有菌屬，而模型組缺如；與疏肝理脾高劑量組比較，有7個(gè)菌屬如脫硫弧菌屬、未特指的丹毒絲菌屬、念珠菌屬、腸球菌屬、耐鹽咸海鮮球菌屬、草酸桿菌屬、柱狀弧菌屬僅在模型組中被檢測(cè)到，為模型組所特有，而疏肝理脾高劑量組缺如；雖然這25個(gè)菌屬豐度低（每個(gè)菌屬所占比例<1%），但仍可提示與模型組比較，本研究中疏肝理脾高劑量組大鼠在屬水平上腸道微生物發(fā)生了明顯的變化。（見(jiàn)圖3）

圖2 各組大鼠腸道菌群OUTs分析圖

圖3 兩個(gè)分組在屬水平上的相對(duì)分布情況柱形圖（相對(duì)豐度前20的物種）

圖3示，模型組和疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群物種的組成存在明顯差異，優(yōu)勢(shì)菌群種類雖未發(fā)生變化，但所占的比例發(fā)生了變化。模型組的擬桿菌屬、梭菌屬、未指明的腸桿菌屬少于疏肝理脾高劑量組，而勞特氏菌屬、糞球菌屬則有所增多。這5種菌群的變化特征與以往報(bào)道的非酒精性脂肪肝炎的腸道菌群變化相符[8-9]。值得觀察的是疏肝理脾高劑量組大鼠的腸道菌群出現(xiàn)模型組所沒(méi)有的菌群，如乳酸球菌屬、考拉桿菌屬等18種菌屬，而模型組所具有的菌群如脫硫弧菌屬、未特指的丹毒絲菌屬等7種菌屬卻缺如，考慮為隨著藥物的使用，疏肝理脾高劑量組屬水平的菌群種類多于模型組，提示大鼠腸道菌群的豐度及豐富度明顯高于模型組。分析可能隨著藥物的治療作用，疏肝理脾高劑量組大鼠腸道潛在有益菌占據(jù)了優(yōu)勢(shì)，數(shù)量與種類較正常組增多，而致病菌卻失去了優(yōu)勢(shì)逐漸減少直至消失。

2.4 Beta多樣性分析Beta多樣性分析中Bray crutis距離表示樣本間豐富度差異，樣本之間距離越遠(yuǎn)，樣本間物種豐富度差異越大；unweight unifrac距離反映樣本間物種的有無(wú)，樣本間距離相距越遠(yuǎn)，提示物種間差異性越顯著。本研究通過(guò)分析Beta多樣性指數(shù)，比較組間菌群結(jié)構(gòu)間的差異性，觀察NASH大鼠經(jīng)過(guò)高劑量疏肝理脾湯治療后腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化情況。結(jié)果提示模型組和疏肝理脾高劑量組Bray crutis及unweight unifrac均較遠(yuǎn)且無(wú)交集，兩者在豐富度和物種組成方面有較大差異（見(jiàn)圖4）。圖5為基于Unweighted Unifrac距離進(jìn)行的NMDS分析PERM ANOVA，經(jīng)過(guò)比較，疏肝理脾高劑量組大鼠與模型組大鼠間有顯著的差異，說(shuō)明模型組和疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群間存在顯著差異。從圖中可以預(yù)估出疏肝理脾高劑量組對(duì)NASH大鼠有一定的治療作用，可能與大鼠腸道菌群改變相關(guān)。

圖4 模型組與疏肝理脾高劑量組Bray crutis（左）、unweight unifrac（右）圖

圖5 基于Unweighted Unifrac距離進(jìn)行的NMDS分析PERMANOVA

2.5 組間差異顯著性分析 采用LEfSe（LDA Effect SiSe）法對(duì)模型組與疏肝理脾高劑量組組間進(jìn)行特征性差異菌，分析屬水平上的差異菌，LDA>4提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以LDA>4.8為標(biāo)準(zhǔn)篩選本次分析中的特征性差異菌。（見(jiàn)圖6）

圖6 模型組（A）和疏肝理脾高劑量組（B）大鼠糞便差異菌LDA評(píng)分圖圖6模型組（A）和疏肝理脾高劑量組（B）大鼠糞便差異菌LDA評(píng)分圖

圖7顯示模型組大鼠屬水平豐度較高的菌群依次為普氏菌科、毛螺菌科、草酸桿菌科、韋榮氏球菌科。疏肝理脾高劑量組大鼠屬水平豐度較高的菌群依次為擬桿菌科、土桿菌科、土桿菌、梭菌科、脫鹵桿菌科。上述分析提示模型組與疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群豐度存在明顯差異。

圖7 模型組（A）和疏肝理脾高劑量組（B）大鼠糞便差異菌進(jìn)化分支圖

2.6 腸道菌群構(gòu)成變化 采用熱圖分析對(duì)腸道菌群構(gòu)成變化進(jìn)行研究。選取總豐度排名前30的OTU繪制進(jìn)化關(guān)系樹(shù)圖，同時(shí)結(jié)合OTU在各個(gè)分組的絕對(duì)豐度進(jìn)行熱圖可視化展示。（見(jiàn)圖8）

圖8 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)及組間豐度分布熱圖

圖8顯示了不同菌群在不同部位的聚集情況。模型組與疏肝理脾高劑量組的OTU聚類更加直觀地表現(xiàn)了正常對(duì)照組腸道菌群結(jié)構(gòu)變化：（1）毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普氏菌科（Prevotellaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、韋榮氏菌科（Veillonellaceae）為模型組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌，在疏肝理脾高劑量組豐度下降；（2）梭菌科（Clostridaceae）、厚壁菌門（Peptostreptococcaceae）、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、S24-7、Erysipelotrichaceae為疏肝理脾高劑量組大鼠腸道菌群的優(yōu)勢(shì)菌，在模型組豐度下降，擬桿菌科、梭菌科為大腸中的優(yōu)勢(shì)菌在模型組豐度明顯降低；（3）S24-7、擬桿菌科（Bacteroidaceae）、梭菌科（Clostridaceae）、Erysipelotrichaceae在結(jié)腸和糞便中豐度較多且相似，但在模型組已經(jīng)分散開(kāi)來(lái)；（4）毛螺菌科（Lachnospiraceae）、普氏菌科（Prevotellaceae）在模型組豐度明顯高于疏肝理脾高劑量組。

3 討 論

NAFLD已經(jīng)成為影響全球近三分之一成年人的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前我國(guó)大陸地區(qū)NAFLD患病率為29.81%[10]，其中NASH占10%～20%，NASH患者10～15年內(nèi)肝硬化發(fā)生率高達(dá)15%～25%，而美國(guó)近10年因NASH進(jìn)展接受肝移植登記累計(jì)增加97%[11-12]。然而，目前針對(duì)NAFLD防治，歐美指南推薦胰島素增敏劑，抗氧化劑E，以及他汀類藥物、貝特類藥物等，其多以改善NASH某一方面代謝性障礙癥狀為主，存在不能明顯改善肝臟脂質(zhì)沉積及炎癥反應(yīng)等缺陷，若出現(xiàn)合并其他疾病時(shí)需要聯(lián)合用藥，加大了不良反應(yīng)和副作用發(fā)生率[13-14]。因此研究有效阻斷NAFLD向NASH進(jìn)展，探索NAFLD早期防治方法，具有十分重要的意義。

中醫(yī)學(xué)一般將NASH歸屬于“痞病”“肥胖病”等范疇，肝郁、脾虛、痰瘀為其基本病機(jī)，治療上多數(shù)采取疏肝、健脾、祛濕等治療方法[15-16]。病因上早期多見(jiàn)肝郁氣滯伴脾氣虛，脾虛益甚，日久肝脾腎俱虛，但無(wú)論是肝郁還是腎虛，都與脾密切相關(guān)，中醫(yī)強(qiáng)調(diào)肝、脾的關(guān)聯(lián)性及相互依賴、相互影響作用。如《素問(wèn)·痹論篇》云：“飲食自倍，腸胃乃傷。”繆希雍于《本草經(jīng)疏》云：“飲啖過(guò)度，好食油面豬脂，濃厚膠固，以至脾氣不利，壅滯為患，皆痰所為”。《溫?zé)峤?jīng)緯》謂：“過(guò)逸則脾滯，脾氣滯而少健運(yùn)，則飲停濕聚矣”。飲食不節(jié)，勞逸失度，情志失調(diào)等所致脂肪肝，皆以脾虛為病理基礎(chǔ)，脾氣虧損貫穿并影響疾病的全過(guò)程。“肝病實(shí)脾”理論來(lái)源《金匱要略》：“夫治未病者，見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾，四季脾旺不受邪，即勿補(bǔ)之。”肝屬木，脾屬土，它們?cè)谏砩匣ハ嘁蕾嚕±砩匣ハ嘤绊懀尾∽钜讉髌ⅲ蕪?qiáng)調(diào)在治肝的同時(shí)，先調(diào)補(bǔ)脾氣，使脾臟正氣充實(shí)不受邪侵。故從中醫(yī)理論認(rèn)識(shí)NASH，脾虛是其主要病機(jī)之一，健脾是NASH的一個(gè)重要治則。

以“肝病實(shí)脾”理論為指導(dǎo)的代表方疏肝理脾湯是我院治療慢性肝病經(jīng)典復(fù)方。疏肝理脾湯源于疏肝健脾名方柴芍六君子湯，由柴胡、茯苓、白芍、白術(shù)、砂仁、甘草等組成。方中柴胡疏肝行氣為君藥；茯苓健脾利濕，白芍養(yǎng)血柔肝為臣藥；白術(shù)健脾燥濕，砂仁溫中化濕，健脾消食為佐藥；甘草調(diào)和諸藥為使藥，共奏疏肝健脾之功效。我院多年臨床應(yīng)用表明，其在改善各類慢性肝病炎癥和纖維化方面，尤其伴有腹脹、腹瀉、大便不調(diào)等脾虛癥狀臨床療效顯著。

“腸-肝軸”理論的提出發(fā)展了NAFLD的“多重打擊”學(xué)說(shuō)，腸道菌群豐度被破壞，腸黏膜屏障功能穩(wěn)定性失衡，通透性增高，腸源性細(xì)菌/脂多糖（LPS）易位到腸外臟器，觸發(fā)NAFLD患者肝臟炎癥和肝損傷效應(yīng)，以及腸道微生物群通過(guò)改變腸道菌群數(shù)量、比例和菌種性質(zhì)，可影響機(jī)體正常生理活動(dòng)[17-19]。故重建腸道菌群穩(wěn)態(tài)成為當(dāng)前阻止NASH持續(xù)進(jìn)展的研究新熱點(diǎn)。腸道菌群與NASH關(guān)聯(lián)性研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NASH大鼠及患者腸道擬桿菌門降低，厚壁菌門降低，變形菌門、腸桿菌科增加，充分說(shuō)明腸道菌群與NASH存在多途徑、多靶點(diǎn)密切關(guān)聯(lián)[20-22]。基于此，在中醫(yī)“肝病實(shí)脾”理論指導(dǎo)下，本課題組采用疏肝健脾法配伍的疏肝理脾湯干預(yù)NASH大鼠。研究發(fā)現(xiàn)疏肝理脾湯可通過(guò)上調(diào)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)，下調(diào)TLR4從而達(dá)到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，改善腸黏膜組織緊密連接，降低炎性因子表達(dá)等的作用[23]。

本研究通過(guò)16S rRNA高通量焦磷酸測(cè)序法對(duì)腸道微生物群落菌種組成、豐度、多樣性，以及菌群結(jié)構(gòu)的差異特征進(jìn)行特異性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)疏肝理脾湯能明顯提高NASH大鼠腸道菌群中梭菌科、擬桿菌科比例，降低普氏菌科、毛螺菌科比例，表明疏肝理脾湯可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群構(gòu)成比影響腸道菌群屬水平，恢復(fù)腸道微生態(tài)環(huán)境平衡。下一步我們將基于腸道微生物穩(wěn)態(tài)性結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)尋找出關(guān)鍵差異性代謝產(chǎn)物及可能關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵代謝信號(hào)通路，為后期研究提供新靶點(diǎn)。