桔梗總皂苷對反流性食管炎大鼠食管黏膜損傷的修復作用及對TLR4/NF-κB通路的影響*

李有連，張秉麗，霍成英

（青海仁濟醫院，青海 西寧 810021）

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）指胃、十二指腸內容物反流至食管引起的食管炎性病變，典型癥狀為燒心、反酸和胸痛，嚴重者可出現食管黏膜糜爛出血及瘢痕形成，造成永久性損傷[1-2]。雖然亞洲人群RE發生率低于歐美國家，但近年來呈逐年上升趨勢[3]。質子泵抑制劑、促胃動力藥和抗抑郁藥是臨床常用的抗RE藥物，其中質子泵抑制劑在抑制胃酸分泌和減輕RE患者的疼痛方面最有效，但仍有20%～30%的患者使用后無明顯效果[4]。另外，質子泵抑制劑不能完全治愈RE，長期使用質子泵抑制劑還可能誘發嚴重不良反應，尋找新的治療RE的藥物和方法具有重要意義[5]。桔梗為臨床常用中藥，具有止咳祛痰、宣肺、排膿等作用，桔梗總皂苷為桔梗主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等藥理作用[6]。研究表明，含有桔梗的中藥方劑如桔梗枳殼湯、桔梗湯等對RE具有較好的治療作用，而桔梗治療RE的作用機制尚不清楚[7-8]。本研究擬探討中藥桔梗的主要活性成分桔梗總皂苷對RE大鼠的治療作用并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6周齡SPF級健康SD大鼠75只，體質量180～220 g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養條件為室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，每天定時換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。研究方案獲醫學實驗動物管理委員會批準，倫理審批號：QHRJ20200503。

1.2 藥物與試劑 桔梗總皂苷（西安冠宇生物技術有限公司，純度：80.75%，批號：20180127）；蘭索拉唑（江蘇康緣藥業股份有限公司，批號：190504）；莫沙必利（江蘇豪森藥業股份有限公司，批號：170107）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號：E-EL-R2856c）、白細胞介素-6（IL-6）試劑盒ELISA（批號：E-EL-R0896c）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（批號：E-BC-K022-M）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（批號：E-EL-0060c）均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific，批號：K1622）；Toll樣受體4（tolllike receptor 4，TLR4）兔源單克隆抗體（批號：66350-1-Ig）、髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）兔源單克隆抗體（批號：23230-1-AP）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65兔源單克隆抗體（批號：66535-1-Ig）均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 主要儀器IX53顯微鏡（日本奧林巴斯）；Multiskan MK3酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；7500型定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.4 分組與造模75只SPF級SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、西藥組（蘭索拉唑+莫沙必利）、桔梗總皂苷高劑量組、桔梗總皂苷低劑量組，每組15只。除正常對照組外，其余各組大鼠均建立RE模型，造模方法參考文獻[9]，大鼠造模前1天禁食不禁水，腹部正中區域備皮、消毒、打開腹腔，幽門和十二指腸交界處使用幽門夾結扎至直徑4.2 mm，并用2-0線結扎2/3胃底，檢查大鼠胃和十二指腸部位無出血后，向腹腔注射5%甲硝唑1 mL和2萬IU慶大霉素，用3-0線縫合腹部切口。正常對照組大鼠不造模，僅在開腹后將胃及十二指腸等組織置于腹腔外5 min后關腹，術后禁食24 h。若HE病理切片檢測顯示大鼠食管黏膜層充血、潰瘍和糜爛，有大量炎癥細胞浸潤，上皮細胞有壞死和增生現象，則表明RE模型建立成功。

1.5 實驗給藥 造模后第3天給藥，西藥組和桔梗總皂苷高、低劑量組大鼠的給藥劑量經課題組前期研究確定[10]，西藥組大鼠灌胃蘭索拉唑（10 mg/kg）和莫沙必利（2 mg/kg）溶液，桔梗總皂苷高、低劑量組大鼠灌胃100、50 mg/kg桔梗總皂苷溶液，正常對照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續14 d。記錄大鼠術前及治療結束后的體質量、存活率。

1.6 觀察指標

1.6.1 HE染色觀察食管黏膜病理變化 末次給藥后2 h，將大鼠麻醉后處死，收集食管組織，4%多聚甲醛固定，蒸餾水清洗，脫水、透明后制作石蠟切片（厚度為4 μm），脫蠟、復水后行HE染色觀察食管黏膜病理變化，病理分級參考《RE診斷及治療指南》[11]進行評定，反流性食管炎病理分級見表1，正常計為0分，輕度計為1分，中度計為2分，重度計為3分。（見表1）

表1 反流性食管炎病理分級

1.6.2 TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力 剝取大鼠食管黏膜組織，加入預冷PBS緩沖液，冰上勻漿，10000 r/min離心10 min取上清，根據ELISA試劑盒說明書步驟檢測食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力。

1.6.3 Western blotting檢測TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表達水平 剝取大鼠食管黏膜組織，冰上研磨勻漿，加入裂解液提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer混勻后煮沸5 min使蛋白變性。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入不同的一抗稀釋液，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，TBST清洗后將PVDF膜放入二抗稀釋液（1∶1 000）中，37℃孵育2 h洗膜，滴加發光液，置凝膠成像系統顯影。

1.6.4 RT-PCR檢測TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達水平 剝取大鼠食管黏膜組織，冰上研磨，提取總RNA，使用RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設計合成，所有樣品均以GAPDH為內參。反應體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應條件為：95℃5 min，95℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應，實驗重復3次。采用2-△△CT的方法計算目的基因mRNA相對表達水平的變化。引物序列見表2。

表2 基因的引物序列

1.7 統計學方法 應用SPSS 25.0統計軟件，實驗指標的檢測均重復3次，計量資料以“均數±標準差”（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 體質量及一般情況比較 造模前，各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。治療結束后，模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠體質量均低于正常對照組（P＜0.05）。與正常對照組比較，模型組大鼠精神狀態差，毛發凌亂無光澤，活動和飲食減少，口周反流黃色黏液。與模型組比較，西藥組、桔梗總皂苷高劑量組大鼠體質量增加（P＜0.05），精神狀態好，毛發略疏松，無反流黏液。西藥組大鼠體質量與桔梗總皂苷高劑量組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），兩組大鼠體質量均高于桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。正常對照組、模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠存活率分別為100%（15/15）、73.33%（11/15）、86.67%（13/15）、93.33%（14/15）、80.00%（12/15）。（見圖1）

圖1 各組大鼠體質量比較

2.2 各組大鼠食管黏膜病理變化比較 正常對照組大鼠食管黏膜正常。模型組大鼠食管黏膜上皮細胞可見大量炎癥細胞浸潤，部分食管黏膜上皮細胞壞死、增生，黏膜糜爛，潰瘍區域有肉芽組織和纖維化形成，病理學評分高于正常對照組（P＜0.05）。與模型組比較，西藥組、桔梗總皂苷高劑量組、桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜損傷明顯改善，炎癥細胞浸潤減輕，病理學評分降低（P＜0.05）。西藥組和桔梗總皂苷高劑量組大鼠食管黏膜部分區域呈現上皮增生，無明顯潰瘍和壞死區域，兩組病理學評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織偶見潰瘍、糜爛和細胞壞死，病理學評分高于西藥組和桔梗總皂苷高劑量組（P＜0.05）。（見圖2、表3）

圖2 各組大鼠食管黏膜組織病理變化比較（HE，×400）

表3 各組大鼠食管黏膜組織病理分級和評分比較

2.3 各組大鼠食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比較 與正常對照組比較，模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織SOD活力均降低（P＜0.05），TNF-α、IL-6、MDA含量均升高（P＜0.05）。與模型組比較，西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織SOD活力均升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6、MDA含量均降低（P＜0.05）。與西藥組比較，桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織SOD活力均升高（P＜0.05），MDA含量均降低（P＜0.05），而TNF-α、IL-6含量與西藥組比較，差異無統計學意義（P＞0.05），其中桔梗總皂苷高劑量組的作用優于桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比較）

表4 各組大鼠食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比較）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05；與桔梗總皂苷高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）正常對照組 15 92.02±6.33 62.21±6.12 1.19±0.31 13.88±0.65模型組 11 251.36±10.12a 209.74±11.54a 2.98±0.40a 8.12±0.54a西藥組 13 160.22±9.57ab 139.97±7.97ab 2.21±0.28ab 8.88±0.72ab桔梗總皂苷高劑量組14 162.35±9.65ab 138.96±6.24ab 1.55±0.22abc 10.95±0.68abc桔梗總皂苷低劑量組12 190.25±11.96abcd 161.34±9.88abcd 1.84±0.35abcd 9.34±0.73abcd

2.4 各組大鼠食管黏膜組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達比較 模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白相對表達量均高于正常對照組（P＜0.05）。西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白相對表達量均低于模型組（P＜0.05）。桔梗總皂苷高劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對表達量均低于西藥組和桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達Western blotting圖

圖4 各組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表達情況（）

2.5 各組大鼠食管黏膜組織TLR4/NF-κB信號通路mRNA表達比較 模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對表達量均高于正常對照組（P＜0.05）。西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對表達量均低于模型組（P＜0.05）。桔梗總皂苷高劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對表達量均低于西藥組和桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對表達量比較（x±s）

3 討 論

RE是臨床多發的消化系統常見疾病，雖然多數患者經質子泵抑制劑等抑酸藥治療后病情得到顯著改善，但仍有部分患者療效較差，病情易反復，且長期使用質子泵抑制劑仍存在較多的不良反應，尋找和開發新的治療藥物具有重要意義[12-13]。桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根，治療食管炎具有較好的臨床療效，其作用機制值得進一步闡明[14]。桔梗中含有皂苷、黃酮、多糖等活性成分，皂苷被認為是桔梗的特征性成分和主要活性成分[15]。本研究探討了桔梗總皂苷對RE大鼠的治療作用及其作用機制。

本研究顯示，RE模型大鼠體質量降低，生存質量下降，食管黏膜上皮層細胞有壞死和增生，部分組織呈纖維化狀態，炎癥細胞浸潤明顯，病理學評分顯著增加。桔梗總皂苷干預后，大鼠體質量增加，食管黏膜損傷得到明顯改善，病理學評分低于模型組，表明桔梗總皂苷對RE食管黏膜損傷具有保護和修復作用。SOD是一種重要的抗氧化酶，SOD的水平可反映機體清除自由基的能力；MDA則與組織細胞受損程度相關，是氧自由基損傷組織細胞后產生的脂質過氧化物[16]。研究表明，食管黏膜損傷與局部氧自由基生成過多有關，應用抗氧化劑可以預防和治療RE[9]。本研究結果表明，桔梗總皂苷可提高RE大鼠食管黏膜組織SOD活力，降低MDA含量，高劑量與低劑量桔梗總皂苷抗氧化應激作用優于西藥，表明一定劑量的桔梗總皂苷能抑制RE造成的食管黏膜組織氧化應激損傷，也可能表明反流性食管炎的治療應當聯合外源性抗氧化劑，而不是僅使用抑酸藥和促胃動力藥。TNF-α是炎癥趨化和激活因子，其含量與炎癥活動呈正相關。IL-6是由活化的T細胞、B細胞、成纖維細胞產生的多效應細胞因子，具有廣泛的促炎作用[17]。本研究結果表明，桔梗總皂苷可降低RE大鼠食管黏膜組織TNF-α和IL-6含量，表明桔梗總皂苷能抑制反流性食管炎相關炎癥反應。TLR4是一種細胞膜表面受體，通過識別病原體細胞壁的保守成分誘發機體炎癥免疫反應。MyD88是Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）家族下游炎癥通路的經典分子。MyD88可通過TLRs家族成員激活NF-κB信號通路，介導炎癥和氧化應激反應等病理過程[18-19]。研究表明，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可抑制炎癥、氧化應激反應和細胞凋亡[20-21]。本研究結果表明，模型組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65表達水平高于正常對照組，桔梗總皂苷干預后，TLR4、MyD88和NF-κB p65表達水平降低，表明桔梗總皂苷可抑制RE大鼠食管黏膜TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活。

綜上所述，桔梗總皂苷可減輕RE大鼠食管黏膜損傷，促進組織修復，減輕炎癥和氧化應激反應，其作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化有關。