紫蘇葉多糖通過Wnt/PCP通路對慢阻肺大鼠氣道炎癥反應(yīng)及氣道重塑的作用研究*

王文靜，劉雪梅，張桂琴

（包頭市第四醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見慢性呼吸道疾病，主要特征為氣流持續(xù)受限、肺功能下降，臨床表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難等。本病病程長，易反復(fù)發(fā)作，后期可引起慢性肺源性心臟病、呼吸衰竭等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類生命健康[1]。氣道重塑是COPD的基本病理特征，是導(dǎo)致氣道狹窄及肺功能下降的重要因素[2]。目前臨床尚缺乏有效抑制氣道重塑的藥物，探索有效治療藥物對于延緩COPD進(jìn)展、抑制氣道重塑具有重要意義。紫蘇是常用傳統(tǒng)中藥，已有研究證實(shí)，紫蘇在COPD中具有抗炎作用，可延緩疾病進(jìn)展[3]。紫蘇葉是紫蘇的重要藥用部位，含有豐富維生素和蛋白質(zhì)，具有較高食用和保健價(jià)值[4]。多糖是紫蘇葉重要活性成分之一，目前關(guān)于其對COPD是否有效報(bào)道尚少。本研究通過建立COPD大鼠模型，擬探討紫蘇葉多糖對COPD的影響及可能作用機(jī)制，為臨床治療COPD提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物8周齡SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量200～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。購入后飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，使用許可證號：SYXK（蒙）2016-0004，保持溫度22～24℃，濕度50%～60%，明暗循環(huán)12 h/12 h，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飼喂標(biāo)準(zhǔn)鼠糧及純凈水，大鼠自由采食飲水。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》，確保動物福利倫理，經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會審核批準(zhǔn)，倫理審批號：BT201800036。

1.2 藥物與試劑 紫蘇葉多糖（陜西斯諾特生物科技有限公司，純度：98%，批號：2018112506）；中南海牌過濾嘴香煙（北京卷煙廠，批號：118204）；無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族（wingless-type MMTV integration site family，Wnt）激動劑氯化鋰（lithium chloride，LiCl）（美國Sigma公司，批號：213233）；脂多糖（lip opolysacchari de，LPS）（北京索萊寶科技有限公司，批號：L2280）；大鼠白介素-8（interleukin-8，IL-8）ELISA試劑盒（批號：SEKR-0071）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：YM-A7056）均購自北京索萊寶科技有限公司）；兔抗大鼠Wnt5a抗體（批號：ab227229）、ras同源蛋白A（ras-homologous A，RhoA）抗體（批號：ab187027）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）抗體（批號：ab126424）、p-JNK抗體（批號：ab2074477）均購自美國Abcam公司）。

1.3 主要儀器FlexiVent動物肺功能儀（加拿大SCIREQ公司）；JJ-12J脫水機(jī)和JB-P5包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機(jī)（德國徠卡公司）；BA210T顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；164-5056電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 造模與分組 取40只大鼠，參照文獻(xiàn)[5]，采用煙熏聯(lián)合氣管滴入LPS復(fù)合法建立COPD大鼠模型。煙熏方法：自制有機(jī)玻璃煙熏箱，四周留直徑約1.5 cm的排氣孔，燃燒12支香煙，每次約10 min，間隔2 h，再燃燒1次。氣管內(nèi)注入LPS：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，頸部消毒，切開皮膚后分離皮下組織，暴露氣管，向氣管內(nèi)注入200 μL（1 μg/μL）LPS，注射完畢后使大鼠直立并左右旋轉(zhuǎn)，使LPS均勻分散至肺中，縫合皮膚，消毒創(chuàng)口。分別于實(shí)驗(yàn)的第1天和第15天，氣管各注入1次LPS，其余時(shí)間每天將大鼠放入煙熏箱內(nèi)按上述方法進(jìn)行煙熏，共持續(xù)4周。實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠表現(xiàn)為精神萎靡，毛發(fā)無光澤并發(fā)生脫落，少動，呼吸急促，出現(xiàn)明顯咳嗽癥狀，表示造模成功，本實(shí)驗(yàn)所有大鼠均造模成功。造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、LiCl組、紫蘇葉多糖組、紫蘇葉多糖+LiCl組，每組10只。另取10只大鼠作為假手術(shù)組，采用相同方法暴露氣管，注入等量生理鹽水，不進(jìn)行煙熏。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 末次煙熏后24 h，LiCl組大鼠皮下注射LiCl，60 mg/kg，并灌胃生理鹽水；紫蘇葉多糖組大鼠皮下注射生理鹽水，并灌胃紫蘇葉多糖，20 mg/kg；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠皮下注射LiCl，60 mg/kg，并灌胃紫蘇葉多糖，20 mg/kg；假手術(shù)組和模型組大鼠皮下注射并灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)4周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 肺功能 末次干預(yù)后2 h，麻醉大鼠，頸部備皮，暴露氣管，進(jìn)行氣管插管，采用肺功能儀檢測用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC），1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，F(xiàn)EV1），呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）。

1.6.2 IL-8、TNF-α水平 肺功能檢測完畢后，隨機(jī)取5只大鼠，結(jié)扎右支氣管，用注射器抽取10 mL生理鹽水，分3次灌洗，30 s后緩慢回抽，收取肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），回收率＞80%。1 500 r/min，4℃離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-8、TNF-α水平。

1.6.3 肺組織學(xué)觀察 灌洗完畢后，脫頸椎處死大鼠，切取右肺組織，浸入4%多聚甲醛中進(jìn)行固定24 h，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片（片厚4 μm），常規(guī)HE染色，透明、脫水、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，參照李佳藝等[6]的方法，測量視野長度和寬度，計(jì)算視野面積，計(jì)數(shù)視野中肺泡總數(shù)，計(jì)算平均肺泡數(shù)（mean alveolar number，MAN），MAN=肺泡總數(shù)/視野面積；標(biāo)記視野中央“十”字線的肺泡間隔數(shù)，測量“十”字線長度，計(jì)算肺泡平均間隔內(nèi)襯（mean linear intercept，MLI），MLI=“十”字線長度/肺泡間隔數(shù)。

1.6.4 氣管壁及氣管平滑肌厚度 隨機(jī)選取每只大鼠HE切片中3個(gè)完整支氣管（直徑1 000～1 500 μm），使用Image圖像分析系統(tǒng)測定支氣管總面積、管腔面積、管壁內(nèi)周長、平滑肌外側(cè)面積和平滑肌內(nèi)側(cè)面積，支氣管壁厚度=（支氣管總面積-管腔面積）/管壁內(nèi)周長，平滑肌厚度=（平滑肌外側(cè)面積-內(nèi)側(cè)面積）/管壁內(nèi)周長。

1.6.5 肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白 各組剩余大鼠脫頸椎處死后，取肺保存于液氮中，取100 mg凍存肺組織提取總蛋白，并進(jìn)行定量，制備SDS-PAGE膠，蛋白上樣進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，加入封閉液室溫封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜，洗膜，加二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，顯影，Image軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠FVC、FEV1、PEF均降低（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠FVC、FEV1、PEF均降低，紫蘇葉多糖組大鼠FVC、FEV1、PEF均升高（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠FVC、FEV1、PEF高于LiCl組（P＜0.05），而低于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

表1 各組大鼠肺功能指標(biāo)比較

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）FVC（mL）FEV1（mL） PEF（L/s）假手術(shù)組 10 - 10.36±0.65 5.13±0.15 35.52±1.59模型組 10 - 4.27±0.45a 2.09±0.09a 18.79±0.96a LiCl組 10 60 2.89±0.36b 1.65±0.08b 12.48±0.83b紫蘇葉多糖組 10 20 8.47±0.59b 4.21±0.13b 28.79±1.32b紫蘇葉多糖+LiCl組10 20+60 6.05±0.53c d 3.17±0.11c d 23.51±1.24c d F 333.782 434.076 531.774 P 0.000 0.000 0.000

2.2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均升高（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均降低（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平低于LiCl組（P＜0.05），而高于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較，ng/L）

表2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較，ng/L）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）IL-8 TNF-α假手術(shù)組 5 - 254.13±26.42 265.46±13.49模型組 5 - 605.27±32.48a 365.79±18.16a LiCl組 5 60 687.61±33.51b 396.97±17.62b紫蘇葉多糖組 5 20 424.52±29.43b 303.58±14.79b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 538.91±31.46cd 331.62±15.67cd F 150.474 51.476 P 0.000 0.000

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化 肺部大體觀察：假手術(shù)組大鼠肺表面光滑，體積正常，無斑點(diǎn)，呈粉紅色；模型組大鼠肺體積明顯增大，表面可見黑色斑點(diǎn)，呈蒼白色；LiCl組大鼠肺大體觀察與模型組相似，表面黑色斑點(diǎn)較多，呈蒼白色；紫蘇葉多糖組大鼠肺體積較模型組略大，斑點(diǎn)較少，呈粉紅色；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺表面斑點(diǎn)多于紫蘇葉多糖組，但少于模型組，體積較大，呈粉白色。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織大體觀察

HE染色顯示，假手術(shù)組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔未見擴(kuò)大，肺間隔未見增厚，未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠肺泡腔擴(kuò)大，部分融合成肺大泡，肺泡壁增厚，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤；LiCl組大鼠肺組織病理變化與模型組相似，肺泡腔擴(kuò)大、斷裂、融合，肺間隔增厚，出現(xiàn)的大量炎癥細(xì)胞；紫蘇葉多糖組大鼠肺組織病變較模型組明顯改善，肺泡結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡擴(kuò)張明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺組織病變較模型組明顯改善，但較紫蘇葉多糖組肺泡擴(kuò)張嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞增加。（見圖2）

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化比較（HE，×200）

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠MLI增加，而MAN減少（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠MLI增加，而MAN減少（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠MLI減少，而MAN增加（P＜0.05）；與紫蘇葉多糖組比較，紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠MLI增加，而MAN減少（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠MLI、MAN比較

表3 各組大鼠MLI、MAN比較

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）MLI（×10-6m）MAN（×106個(gè)/m2）假手術(shù)組 5 - 52.56±6.52 174.32±10.52模型組 5 - 102.49±8.96a 92.16±7.45a LiCl組 5 60 121.24±10.85b 76.85±7.16b紫蘇葉多糖組 5 20 71.23±8.15b 136.58±11.85b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 85.63±8.49cd 108.71±9.87cd F 46.969 81.875 P 0.000 0.000

2.4 各組大鼠支氣管壁及氣管平滑肌厚度比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均增加（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均增加（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均減小（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度低于LiCl組，而高于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度比較±s，μm2/μm）

表4 各組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度比較±s，μm2/μm）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）支氣管壁厚度 平滑肌厚度假手術(shù)組 5 - 18.26±1.35 11.47±1.13模型組 5 - 35.49±2.54a 24.56±1.87a LiCl組 5 60 43.76±3.32b 32.48±1.92b紫蘇葉多糖組 5 20 25.92±2.12b 14.39±1.26b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 29.96±2.35c d 19.65±1.49c d F 79.242 142.444 P 0.000 0.000

2.5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達(dá)量均增加（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達(dá)量均增加（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達(dá)量均減少（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達(dá)量低于LiCl組（P＜0.05），而高于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。5組大鼠肺組織JNK蛋白相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表5、圖3）

表5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較

表5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）Wnt5a RhoA JNK p-JNK假手術(shù)組 5 - 0.13±0.03 0.25±0.04 1.08±0.11 0.26±0.05模型組 5 - 0.81±0.07a 0.79±0.07a 1.03±0.10 0.82±0.08a LiCl組 5 60 1.26±0.08b 0.93±0.08b 1.05±0.13 0.95±0.08b紫蘇葉多糖組 5 20 0.43±0.05b 0.51±0.05b 1.06±0.11 0.56±0.06b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 0.70±0.06cd 0.68±0.06cd 1.02±0.12 0.69±0.07cd F 245.123 91.079 0.218 73.666 P 0.000 0.000 0.926 0.000

圖3 各組大鼠肺組織中Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白表達(dá)電泳圖

3 討 論

COPD與慢性炎癥有關(guān)，反復(fù)慢性炎癥引起的氣道重塑是COPD進(jìn)展的關(guān)鍵病理因素，氣道重塑過程始終伴隨氣道炎癥[7]。吸入煙霧或其他有害顆粒，可激活COPD患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等釋放一系列炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致肺組織炎癥細(xì)胞浸潤；氣道壁釋放各種細(xì)胞因子或炎性介質(zhì)等損傷局部組織，并介導(dǎo)異常修復(fù)過程，引起氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，發(fā)生氣道重塑，最終造成氣管管腔狹窄，進(jìn)行性氣流阻力增加[8-9]。本研究采用煙熏聯(lián)合LPS方法建立COPD大鼠模型，結(jié)果顯示，模型組大鼠肺體積增大，出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)，呈蒼白色，MLI增加，MAN減少，支氣管壁及氣管平滑肌厚度增加，表明COPD模型建立成功，符合氣道重塑病理改變。

減輕炎癥反應(yīng)，防治氣道重塑，是延緩COPD進(jìn)展的關(guān)鍵。紫蘇葉具有止咳平喘、降氣化痰、潤腸通便、理氣止痛等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，紫蘇葉中含有黃酮類、多糖類、揮發(fā)油類等多種生物活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[10]。PARK D D等[11]研究表明，紫蘇葉提取物可減輕TNF-α誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)，對小鼠結(jié)腸炎具有預(yù)防作用。有研究[12]顯示，紫蘇葉提取物可減輕LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究采用紫蘇葉多糖治療COPD大鼠，結(jié)果顯示大鼠肺功能有所提高，BALF中IL-8、TNF-α等炎癥因子水平下降，HE染色結(jié)果顯示肺泡結(jié)構(gòu)大致正常，肺泡擴(kuò)張明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，MLI減少，MAN增加，支氣管壁厚度、平滑肌厚度減小，提示紫蘇葉多糖可抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng)，減輕氣道重塑，改善肺組織病理損傷。

Wnt信號通路異常活化與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Wnt5a可激活非經(jīng)典Wnt信號通路，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)損傷氣道上皮[13]。平面細(xì)胞極性（planar cell polarity，PCP）途徑即Wnt/PCP途徑，是非經(jīng)典Wnt信號通路之一，主要通過調(diào)節(jié)下游RhoA等表達(dá)，激活JNK途徑，破壞組織形態(tài)[14]。RhoA是Wnt/PCP途徑中的關(guān)鍵蛋白，能夠通過細(xì)胞張力調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，與肺部血管重建有關(guān)，其表達(dá)水平與慢性阻塞性肺疾病畸形加重期患者疾病嚴(yán)重程度成正相關(guān)[15]。JNK磷酸化進(jìn)入活化狀態(tài)后，可調(diào)節(jié)下游信號分子，參與細(xì)胞生長、分化等多種過程。已有研究證實(shí)，Wnt/PCP通路在肺發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用，能參與肺氣腫、肺動脈高壓等肺部疾病的發(fā)生[16-17]。為進(jìn)一步研究紫蘇葉多糖對COPD的作用機(jī)制，本研究使用Wnt通路激動劑LiCl干預(yù)COPD大鼠，結(jié)果顯示LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達(dá)量高于模型組，大鼠肺功能、炎癥因子水平、肺部病理變化及氣道重塑情況更嚴(yán)重，表明Wnt/PCP通路激活可促進(jìn)COPD進(jìn)展；本研究在使用紫蘇葉多糖治療的基礎(chǔ)上同時(shí)使用LiCl干預(yù)，結(jié)果顯示，LiCl可抵消部分紫蘇葉多糖的改善作用。由此證實(shí)，紫蘇葉多糖改善COPD氣道重塑，可能與抑制Wnt/PCP通路有關(guān)。

綜上所述，紫蘇葉多糖可抑制COPD大鼠炎癥反應(yīng)，減輕氣道重塑，可能與抑制Wnt/PCP通路有關(guān)。