微波輔助離子液體提取光果蕕黃酮工藝的優化*

閆 平，張 彥，鄭 松

(西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021)

光果蕕(CaryopteristanguticaMaxim.)是馬鞭草科蕕屬植物,主要分布于中國陜西、河南、甘肅、四川等地的干燥山坡或路邊，高0.5～2 m，常野生，是羌族民間藥用植物,具有解毒消腫、消食理氣、活血止痛以及殺蟲等功效[1],常用于治療皮膚濕疹、酒瘡、女性崩漏、白帶和月經不調等疾病。研究發現蕕屬植物具有抗氧化、抗菌、抗病毒等作用[2]，光果蕕提取物具有抗氧化活性，對DPPH自由基、O2-自由基均有良好清除的作用，但是文獻中光果蕕黃酮的提取還只是傳統的索氏提取，提取效率比較低[3]，因此優化光果蕕黃酮的提取工藝，提高光果蕕黃酮得率是研究的關鍵一步，通過文獻查閱，目前微波輔助離子液體在天然產物的提取中表現出非常好的輔助優勢[4]。

離子液體[5-6]是一種綠色溶劑，在室溫下呈液體，其分子作用力和強溶解能力有利于有效成分的溶解，具有穩定性好、溶解度高、蒸氣壓低、應用范圍廣、電學性質優異、安全性高、可重復利用、對微波有良好的吸收效果等優點[7-10]；但離子液體黏度高，不易從所獲得的產物中分離，需要用有機溶劑或超臨界CO2進行反萃，并且價格高昂、具有一定的生物毒性，在后期開發中存在困難。實驗中選擇的離子液體為1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽(C8H15N2Br)，分子量219.12，簡寫[BMZm]Br，其提取范圍較廣，對于黃酮類化合物具有不錯的提取效果[11]，但由于黏度較大，所以實驗中將離子液體加入到體積分數為70%的乙醇中稀釋后再作為提取溶劑使用。

研究采用微波輔助離子液體的方法，結合響應曲面法以及Design-Experts設計響應面實驗優化出光果蕕黃酮的最佳提取工藝，為后期研究光果蕕黃酮生物活性提供一定的理論基礎。

1 實驗部分

1.1 原料、試劑與儀器

光果蕕：采自太白山眉縣，經生藥教研室汪興軍老師鑒定為馬鞭草科光果蕕；蘆丁：L9W6-8YWD，中國食品藥品檢定研究院。

1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽：純度≥97%，中科院蘭州化學物理研究所；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇：分析純，市售。

微波超聲合成/萃取儀：XH-300A，北京祥鵠科技發展有限公司；紫外可見分光光度計：UV-762，上海佑科儀器儀表有限公司；電子天平：PTY-B5000，福州華志科學儀器有限公司；循環水式多用真空泵：SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿有限公司；數顯控溫電熱套：SXKW，北京市永光明醫療器械廠；鼓風干燥箱：BOV101-70-Ⅱ，濟南鑫貝西生物技術有限公司；旋轉蒸發器：XD-52AA，上海賢德實驗儀器有限公司；密封型搖擺式粉碎機：XL-16B，廣州市旭朗機械設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 光果蕕黃酮樣品溶液的制備

取干燥的光果蕕粉碎過篩，t=40 ℃烘干至質量恒定，索氏提取，t=80 ℃石油醚脫脂加熱回流至無色，取出藥材提取包，自然揮發干燥，得到樣品粉末。

精密稱取一定量的樣品粉末置于三頸燒瓶中，加入一定體積溶解有離子液體的φ(乙醇)=70%溶液，放入微波萃取器的化學反應器中，設置一定的微波功率、提取溫度和反應時間，提取完成后抽濾，抽濾液轉移至50 mL容量瓶中并定容，即得光果蕕黃酮樣品溶液。

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁標準品10.0 mg，溶解并定容于100 mLφ(乙醇)=70%溶液中，充分搖勻振蕩，即得到ρ(蘆丁)=0.10 mg/mL的標準溶液。

精密吸取蘆丁標準溶液，按照不同質量濃度梯度進行配置，參考文獻[12]在512 nm處測定吸光度，并繪制標準曲線，得到線性回歸方程y=9.71x+0.055，R2=0.998 9。

1.2.3 光果蕕黃酮含量測定

精密吸取光果蕕黃酮樣品溶液1 mL，移至10 mL容量瓶中，φ(乙醇)=70%溶液定容，充分搖勻，再吸取1 mL，按照1.2.2標準曲線繪制方法進行測定，并根據已得到的線性回歸方程計算樣品溶液的光果蕕黃酮含量，計算光果蕕黃酮得率。

1.3 光果蕕黃酮單因素實驗

用φ(乙醇)=70%溶液作溶劑，光果蕕黃酮得率為評價指標，分別對微波功率、反應時間、V(提取液)∶m(原料)(以下簡稱液料比)、V(乙醇)∶V(離子液體)(以下簡稱離子液體體積比)4個參數進行單因素實驗，以確定各因素對光果蕕黃酮得率的影響以及良好的參數范圍。

1.4 響應曲面設計實驗

在單因素實驗基礎上，采用Design-Expert 8.0.6.1 Trial中的Box-Behnken，以微波功率(A)、反應時間(B)、粉末液料比(C)、離子液體體積比(D)4個因素為變量[13]，以光果蕕黃酮得率為響應值，每個變量按高(+1)、中(0)、低(-1)3個水平進行分析，見表1。

表1 響應面分析因素及水平

2 結果與討論

2.1 單因素提取光果蕕黃酮實驗結果

2.1.1 微波功率對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定離子液體體積比為20、液料比為50 mL/g、反應時間為6 min，考察微波功率對光果蕕黃酮得率的影響，見圖1。

微波功率/W圖1 微波功率對光果蕕黃酮得率的影響

由圖1可知，當微波功率從150 W增至550 W，黃酮得率呈上升趨勢，可能的原因是物料吸收了微波能，內部的分子劇烈運動使細胞破裂，黃酮溶出增加，得率增高[14]；當功率從550 W繼續增至950 W，得率呈下降趨勢，可能的原因是隨著微波功率增加，溫度上升過快,導致黃酮穩定性降低。因此，在后續的響應曲面實驗中采用350、550、750 W的微波功率梯度。

2.1.2 微波反應時間對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定離子液體體積比為50、液料比為20 mL/g、微波功率為550 W，考察反應時間對光果蕕黃酮得率的影響，見圖2。

t/min圖2 反應時間對光果蕕黃酮得率的影響

由圖2可知，t=4～8 min，黃酮得率升高，可能的原因是物料中的黃酮隨反應時間的增加不斷溶出，使得率增高；t=8～20 min，得率持續下降，但下降趨勢較緩。其一可能是反應時間過長，長時間受熱導致所溶出的黃酮被破壞，提取液中的黃酮含量減少，得率降低；其二可能是反應時間過長導致溶液中的雜質溶出增多，黃酮溶出減少，得率降低。因此，在后續的響應曲面實驗中采用4、8、12 min的反應時間梯度。

2.1.3 粉末液料比對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定離子液體體積比為50、反應時間為8 min、微波功率為550 W，考察液料比對光果蕕黃酮得率的影響，見圖3。

液料比/(mL·g-1)圖3 粉末液料比對光果蕕黃酮得率的影響

由圖3可知，液料比為10～20 mL/g時，黃酮快速從植物細胞中溶解出來導致得率直線上升，液料比達到20 mL/g時，得率最高；當液料比繼續增大時，過多的溶劑使微波能傳遞能力逐步減弱，細胞破裂不完全，黃酮不能充分溶解，導致得率不斷下降。因此，在后續的響應曲面實驗中采用10、20、30 mL/g的液料比梯度。

2.1.4 離子液體體積比對光果蕕黃酮得率的影響

精密稱取0.50 g光果蕕粉末于三頸燒瓶中，固定液料比為20 mL/g、反應時間為8 min、微波功率為550 W，考察離子液體體積比對光果蕕黃酮得率的影響，見圖4。

離子液體體積比圖4 離子液體體積比對光果蕕黃酮得率的影響

由圖4可知，當離子液體體積比從10增至40，黃酮得率不斷提高，可能的原因是比值大時溶劑黏稠度變低，擴散能力增強，利于黃酮的溶出[15]；當比值從40增大至50，得率下降，但幅度較小，可能的原因是此時離子液體濃度較低，不利于萃取。因此，后續的響應曲面實驗中采用30、40、50的離子液體體積比梯度。

2.2 響應曲面設計實驗結果

2.2.1 響應曲面設計實驗表

以光果蕕黃酮得率(Y)為響應值，對表1進行四因素三水平評價，得率結果見表2。

表2 響應曲面設計實驗表

對上述方程進行顯著性檢驗和方差分析，黃酮得率回歸模型結果見表3。

表3 顯著性檢驗和方差分析表1)

2.2.2 響應面分析

單因素兩兩之間交互作用的響應曲面圖見圖5～圖10。

圖5 微波功率與反應時間的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖5可知，A、B交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為23.58 mg/g，此時微波功率為750 W，反應時間為12 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖6 微波功率與液料比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖6可知，A、C交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為25.74 mg/g，此時微波功率為750 W，反應時間為8 min，液料比為30 mL/g，離子液體體積比為40。

圖7 微波功率與離子液體體積比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖7可知，A、D交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時微波功率為550 W，反應時間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖8 反應時間與液料比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖8可知，B、C交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時微波功率為550 W，反應時間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖9 反應時間與離子液體體積比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖9可知，B、D交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時微波功率為550 W，反應時間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

圖10 液料比與離子液體體積比的交互作用對光果蕕黃酮得率的影響

由圖10可知，C、D交互作用下光果蕕黃酮得率的極值為18.30 mg/g，此時微波功率為550 W，反應時間為8 min，液料比為20 mL/g，離子液體體積比為40。

通過Design-Exoert 8.0.6 Trial分析得到最佳提取工藝為微波功率750 W，反應時間10.77 min，液料比20.27 mL/g，離子液體體積比37.77，此時的光果蕕黃酮得率預測值為22.99 mg/g。

2.3 驗證性實驗

在最優的提取條件下進行重復性實驗，驗證通過響應曲面建立模型的可靠性，綜合考慮實操性，實際提取條件為微波功率750 W，反應時間11 min，液料比20 mL/g，離子液體體積比38，平行3次實驗，測得光果蕕w(黃酮)=24.83、24.97、25.22 mg/g，平均w(黃酮)=25.01 mg/g，接近預測值，說明響應曲面法優化得到的提取工藝穩定可行。

2.4 微波輔助離子液體提取光果蕕不同部位w(黃酮)

在2.3中驗證了優化后的提取條件，實驗結果表明該條件具有一定的可行性，在該條件下對光果蕕莖、葉、花中的黃酮平行3次提取，結果見表4。

表4 光果蕕不同部位w(黃酮) mg/g

由表4可知，光果蕕莖、葉、花3個部位中都含有一定量的黃酮，葉中最高，花中次之，莖中最少。

3 結 論

采用單因素分析結合響應曲面實驗的方法，研究了微波輔助離子液體提取光果蕕中黃酮的影響因素和工藝條件。實驗結果表明，各因素對光果蕕黃酮得率的影響大小關系依次為微波功率>反應時間>離子液體體積比>液料比，且微波功率影響最大。利用Design-Exoert優化出最佳提取工藝為微波功率750W，反應時間11 min，液料比20 mL/g，離子液體體積比38，在該提取工藝條件下的光果蕕黃酮平均含量為25.01 mg/g。在微波輔助離子液體的雙重作用下，提取光果蕕黃酮具有反應時間短、提取效率高、消耗溶劑較少、實驗操作簡單、無污染等優點。

微波輔助提取技術具有高效、高得率、短提取時間等優點[16-17]，微波結合離子液體相輔相成，極大提高黃酮得率，縮短反應時間，且儀器操作簡單，節省資源，綠色環保，可以為日后的工業發展作參考。