靜脈滴注心房利鈉肽對阿勒泰羊血液脂代謝激素的影響及尾脂轉錄組分析

馬 昕，楊 光,李翔宇,劉越越,陳 勇*

(1.新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆肉乳用草食動物營養實驗室，烏魯木齊 830052)

阿勒泰羊作為典型的地方脂尾型綿羊，尾脂脂肪過度沉積不僅影響畜產品品質，還明顯降低飼料轉化率[1]，減少尾部脂肪沉積正成為養羊業重要的研究領域之一[2]。

心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)主要由心房心肌作為前體激素產生和分泌，已證實ANP可調節水鹽平衡和血壓穩定，且表現出強效的脂解作用[3]。ANP促進脂肪細胞褐變、脂肪分解、脂質氧化和脂肪因子分泌，已成為能量消耗和代謝的重要調節因子。盡管ANP曾被認為僅能促進靈長類動物脂肪細胞的脂解[4]，且ANP在人和嚙齒動物表達中具有同源性[5]，但也有研究證實，綿羊也產生ANP[6]，本實驗室也已發現ANP會影響綿羊脂肪代謝，但其作用機制尚不清楚[7]。本研究利用Illumina高通量測序技術，根據靜脈滴注ANP后阿勒泰羊尾脂基因表達和轉錄組數據，確定ANP對參與綿羊脂解主要通路和關鍵基因表達規律的影響，為闡明綿羊尾部脂肪沉積的分子調控機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

ANP由蘇州強耀生物科技有限公司合成，分子量為3 960.48，純度為98.83%。ANP、脂聯素(adiponectin，ADPN)、胰島素(insulin，INS)、瘦素(leptin，LEP)和環鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)ELISA檢測試劑盒購自上海篤瑪生物科技有限公司。

1.2 試驗設計及飼養管理

在新疆畜牧科學院綿羊繁育試驗基地選取平均體重為(45.6±6.5)kg、健康狀況良好的1.5歲阿勒泰母羊8只。采用自身對照試驗設計，對照期在晨飼前頸靜脈滴注生理鹽水，試驗期在晨飼前頸靜脈滴注ANP溶液。滴注時，綿羊側臥在人工授精保定臺上。對照期時，在(45±2)min內滴注完畢100 mL生理鹽水，連續滴注4 d；試驗期時，將濃度為562.5 μg·mL-1的ANP母液以1.125 μg·kg-1BW的劑量溶解在100 mL生理鹽水中滴注[8]，滴注方式與時間同對照期。滴注結束后自由采食、飲水，飼糧組成及營養水平見表1。

表1 飼糧組成及營養水平(以干物質計)

1.3 樣品采集與處理

每期的第4天分別在滴注前(0 min)和滴注開始后15、30、45、60、90、120 min采集空腹血液，分離血漿并于-20 ℃保存。各期最后一次血樣采集結束后，以鹽酸普魯卡因對尾部局部麻醉后手術采集尾脂0.2 g左右，剪碎后儲存于RNAstore保存液中，于4 ℃過夜后-80 ℃冷凍保存備用。

1.4 激素的測定

ANP、脂聯素、胰島素、瘦素和環鳥苷酸ELISA測定按照產品說明進行。

1.5 RNA提取、cDNA文庫構建及高通量測序

TRIzol法提取脂肪組織總RNA，并檢測純度及完整性。從對照期和試驗期各隨機選取5個合格樣本送至北京諾禾致源科技股份有限公司，利用Illumina的NEBNext?UltraTM RNA Library Prep Kit試劑盒構建樣品的cDNA文庫，經檢測合格的文庫再進行準確定量。隨后使用Illumina HiseqTM 2500平臺進行測序。

1.6 生物信息學分析

測序下機原始數據經質控后得到有效數據，計算有效數據的容錯率以及Q20、Q30、GC的含量，再由HISAT2比對軟件比對序列到參考基因組，獲得比對數及比對率?；虮葘螅ㄟ^DESeq2軟件對兩組測序文庫的有效數據進行差異表達分析，以校正后的P(Padj)<0.05且差異表達倍數值|log2fold change|>1為標準，篩選差異表達基因。并對差異表達基因進行GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.7 qRT-PCR驗證

根據轉錄組分析結果，選取7個與脂肪代謝相關的基因，采用熒光定量PCR進行相對定量(2-ΔΔCt)，驗證高通量測序結果的準確性。在GenBank中搜索綿羊的水通道蛋白7(AQP7)、脂肪酸結合蛋白4(FABP4)、脂滴包被蛋白基因5(PLIN5)、脂聯素受體2(ADIPOR2)、單酸甘油酯脂肪酶(MGLL)、胰島素降解酶(IDE)及長鏈脂酰輔酶A合成酶1(ACSL1)基因mRNA序列信息，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參基因，使用Primer5.0軟件設計引物，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，PCR引物序列見表2。

表2 驗證基因及其引物信息

1.8 數據處理

采用SPSS 19.0軟件進行配對樣本t檢驗分析，GraphPad Prism 8.0進行做圖，所有數據均用“平均值±標準差(mean±SD)”表示，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 靜脈滴注ANP對血漿激素含量的影響

由表3可知，滴注ANP后，血漿中ANP在30、90 min時，試驗期顯著高于對照期(P<0.05)；脂聯素在30 min時，試驗期顯著高于對照期(P<0.05)，90 min時，試驗期血漿中脂聯素含量極顯著高于對照期(P<0.01)；在30、90 min時，試驗期環鳥苷酸含量極顯著高于對照期(P<0.01)，在45、60 min 時，試驗期cGMP含量顯著高于對照期(P<0.05)；胰島素在開始滴注后0、30、120 min時，試驗期極顯著高于對照期(P<0.01)，15、45、60、90 min時，試驗期胰島素含量顯著高于對照期(P<0.05)；瘦素在0、15 min時，試驗期顯著高于對照期(P<0.05)，30 min時，試驗期瘦素含量極顯著高于對照期(P<0.01)。

表3 滴注ANP對阿勒泰羊血漿脂代謝相關激素含量的影響

2.2 轉錄組分析

2.2.1 測序數據質檢 測序獲得的原始數據經質控后平均每個樣本的有效數據為5 407萬條，數據量為8.11G，樣本容錯率均在0.03%以下，Q20、Q30分別超過97%和94%，表明獲得了較高質量測序數據；質控后的有效數據與參考基因組比對后，總比對率>88%，唯一比對率>79%，表明所選參考基因組可以滿足信息分析的需求。

2.2.2 差異表達基因的篩選 以P<0.05且|log2fold change|>1為標準，篩選滴注ANP前后的差異表達基因，發現共有差異基因3 686個，其中1 482個基因上調表達、2 204個基因下調表達，總體基因的表達情況可見火山圖(圖1)。由差異基因熱圖(圖2)可見，組內兩兩樣品的基因表達量基本趨于一致，而組間樣品則存在顯著的基因表達變化，證明樣品間相關性良好，聚類效果較好。表4所示為對照期與試驗期之間脂代謝相關差異基因，PLIN5、PLIN1、MGLL、FABP4、ADIPOR2、AQP1、IDE等與脂肪代謝相關基因的表達量差異極顯著(P<0.01)，表明滴注ANP對阿勒泰羊尾脂中與脂肪代謝相關基因的表達量產生了一定影響。

表4 滴注ANP對阿勒泰羊尾脂脂肪代謝相關基因表達量(FPKM)的影響

圖1 差異基因火山圖

圖2 差異基因熱圖

2.3 轉錄組功能注釋

2.3.1 差異基因的GO功能富集分析 對差異基因進行GO分析共富集到118個生物學功能，其中77.1%為生物過程(biology process, BP)、17.0%為細胞組分(cellular component, CC)、5.9%為分子功能(molecular function, MF)。各功能中富集最顯著的前10條通路見圖3。其中表達上調基因在BP中主要顯著富集在電子傳遞鏈、核苷酸代謝過程、線粒體復合體I的組裝和生物發生及氧化磷酸化相關；在CC中主要顯著富集在核糖體組成部分、線粒體、線粒體膜及呼吸鏈；在MF中主要顯著富集在核糖體的構成部分、NADH脫氫酶活性、rRNA結合位點、谷胱甘肽轉移酶活性及氧化還原酶活性(圖4A)。表達下調基因在BP中主要顯著富集在白細胞活化、淋巴細胞活化、免疫反應激活及免疫應答調控；在CC中主要顯著富集在濃縮染色體及中心體；在MF中主要顯著富集在酶激活劑活性、核苷三磷酸酶調節劑活性、GTP酶激活劑及GTP酶調節劑活性、糖蛋白結合(圖4B)。

圖3 差異表達基因的GO功能富集

A.表達上調基因；B.表達下調基因

2.3.2 差異基因的KEGG通路富集分析 通過KEGG通路富集分析發現，與對照期相比，表達上調基因共富集到262條信號通路中，其中15條通路顯著富集；表達下調基因共富集到284條信號通路中，其中31條通路顯著富集。(除去疾病)其中表達上調基因顯著富集到核糖體、氧化磷酸化、產熱、逆行內源性大麻素信號、細胞色素P450代謝、調節脂肪細胞中的脂肪分解等通路(圖5A)；表達下調基因顯著富集到溶酶體、Toll樣受體信號、B細胞受體信號、NOD樣受體信號、吞噬體、趨化因子信號等通路(圖5B)。其中，與脂代謝和能量相關的主要通路見表5，核糖體、產熱、氧化磷酸化通路極顯著富集(P<0.01)；cAMP信號通路、調節脂肪細胞中的脂肪分解、逆行內源性大麻素信號通路顯著富集(P<0.05)，表明滴注ANP可能通過調控上述通路實現脂解作用。

表5 滴注ANP對阿勒泰羊尾脂脂肪代謝相關KEGG通路的影響

A.表達上調基因；B.表達下調基因

2.4 差異表達基因的驗證

根據功能及代謝通路選取RNA-seq中5個表達上調基因(AQP7、FABP4、PLIN5、ADIPOR2、MGLL)和2個表達下調基因(IDE、ACSL1)，經qRT-PCR驗證。結果如圖6顯示，7個功能候選基因表達水平變化趨勢與RNA-seq結果基本一致。通過qRT-PCR分析可以看出，IDE、ACSL1在滴注ANP后的表達分別顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)下調；ADIPOR2在滴注ANP后的表達顯著上調(P<0.05)，AQP7、FABP4、MGLL和PLIN5則極顯著上調(P<0.01)(圖7)。

圖6 差異基因qRT-PCR驗證

*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

在人體皮下組織中注射ANP可誘導脂肪分解并增加局部血流量，從而增強脂質代謝[9]。本試驗中，試驗期血漿ANP含量均高于對照期，在人與豬模型中輸注適宜劑量ANP后均發現了類似效應[10-11]，表明滴注外源ANP對血漿ANP含量產生了一定影響。胰腺α和β細胞上存在ANP受體NPRA(natriuretic peptide receptor A)，滴注ANP后可能刺激生成更多受體[12]，Birkenfeld等[8]的研究結果表明，受試者胰島素濃度隨著ANP注射的增加而增加，本研究中試驗全期胰島素含量均顯著增加(P<0.05)。ANP和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)的表達來調節體內脂肪分布，促進脂肪細胞脂聯素的分泌[13]。研究表明，BNP可能通過釋放脂肪因子發揮部分代謝作用，BNP與ADPN水平呈正相關[14]，由此推測，BNP的代謝效應可能部分是由脂聯素介導的。本試驗中，試驗全期血漿中ADPN平均水平顯著高于對照期(P<0.05)，Wang等[15]研究也表明，ANP顯著增加了總脂聯素含量，ANP與BNP有類似生物活性，表明ANP也可能是脂聯素分泌的主要刺激因素。NPRA和NPRB與鳥苷酸環化酶受體偶聯，可促進GTP轉化為二級信使cGMP，從而提高尿液和血漿中cGMP的水平，升高的細胞內cGMP進而激活下游效應因子蛋白激酶G(PKG)促進激素敏感脂肪酶和脂滴包被蛋白的磷酸化[16]，本試驗中，就全期平均水平來看，試驗期血漿中cGMP含量極顯著高于對照期(P<0.01)，其他學者研究也有類似結果[17]，表明滴注ANP后，cGMP含量升高刺激脂肪組織脂解。研究表明，瘦素的分泌與脂肪組織中儲存的能量成正比，可通過增強脂肪細胞的生物活性，促進瘦素的釋放[18]。本試驗中，試驗期血漿瘦素含量顯著高于對照期(P<0.05)，ANP刺激脂肪細胞釋放瘦素，高瘦素水平增加脂肪酸氧化，同時減少葡萄糖攝取，導致心臟胰島素抵抗和從葡萄糖向游離脂肪酸代謝的轉變[19]。但瘦素與血漿BNP之間的聯系還受其他神經激素共同調控[20]，同理推及ANP與瘦素之間互作效用還有待探討。較高的胰島素水平和較高的葡萄糖濃度可能通過誘導人脂肪細胞中清除受體NPRC(natriuretic peptide receptor C)的表達，導致ANP介導的脂解減少，從而導致胰島素抵抗[21]，但增加脂聯素的分泌可間接改善ANP的胰島素增敏效果[22]。由此可見，血漿ANP、脂聯素、cGMP、胰島素和瘦素的共同調控可能是聯系ANP和糖脂代謝活動之間的關鍵效用。

研究人員基于RNA-seq技術比較分析同種基因在尾型不同綿羊脂肪組織的相對表達量，以期鑒定遺傳決定因素[23]。為揭示差異表達基因的潛在生理功能，本研究對篩選到的差異表達基因進行GO功能與KEGG通路富集分析。GO功能主要富集在核糖體與線粒體功能，脂代謝受蛋白與能量共同調控，ANP可能間接調控關鍵脂肪細胞分化，實現轉錄因子(PPARγ、CCAAT增強子結合蛋白(C/EBPα)、固醇調節元件結合蛋白1(SREBP-1)等)功能，促使能量代謝相關過程的上調表達基因顯著富集。表達下調的基因主要富集在免疫功能中，表明ANP可能通過某些下調基因參與免疫調節代謝過程。通過KEGG通路富集分析顯示，氧化磷酸化、產熱通路與核糖體及能量產生密切相關，與本研究GO功能富集結果相對應；Carper等[24]發現，ANP是哺乳動物非顫抖產熱的生理性內分泌激活劑，生熱脂肪細胞可通過部分線粒體解偶聯蛋白1(uncoupling protein 1，UCP1)將化學能散失為熱量，以p38MAPK依賴的方式增加棕色脂肪和線粒體標志物的表達。脂肪代謝相關KEGG通路中，cAMP調節胰島素分泌，瘦素直接刺激醛固酮的分泌[25]。表達下調顯著富集的KEGG通路中多數通路與免疫反應通路相關，與本研究GO功能富集分析下調表達結果相對應。

在前期研究滴注ANP后，阿勒泰羊血液中甘油、甘油三酯、游離脂肪酸含量均有不同程度的增加，促進了脂解[7]。Guo等[26]的研究表明，可通過PPAR信號通路依賴方式增強AQP7在脂肪組織中的表達，減輕體重，介導脂肪細胞甘油輸出，改善糖脂代謝。FABP4的表達受PPARγ和C/EBPα在轉錄水平上的調控[27]，FABP4通過下調PPARγ信號通路顯著抑制了脂肪細胞內脂滴的積累和成脂細胞的形成[28]。本研究中，FABP4的上調表達可能與ANP介導脂肪組織(腹脂和內臟脂肪)向尾脂轉運更多脂肪酸有關。PLIN5在脂肪酸氧化程度較高的組織中含量豐富，在cAMP/PKA介導的脂解刺激下，優先與單不飽和脂肪酸結合[29]，Wang等[30]研究發現，骨骼肌中PLIN5過表達促進了PPARγ和PPARγ輔活化子-1α(PGC-1α)共同控制下脂肪酸分解代謝。有研究表明，ANP通過激活AMPKα2亞基活性刺激脂解作用[31]，ADIPOR2參與AMPK信號通路，介導AMPKα2亞基活性和PPAR活性的升高，ADIPOR2還可介導脂聯素激活，刺激PPARα配體表達，導致胰島素敏感性增加，從而調節糖脂代謝[32]。刺激MGLL被抑制后，體內主要的內源性大麻素-2-花生四烯酰甘油酯分泌水平隨之增加[33]，與本研究KEGG中逆行內源性大麻素信號通路上調結果一致。IDE最初被認為具有降解胰島素的能力，后來發現可與ANP相互作用，已經有研究表明，IDE可作為某些疾病的治療靶點，通過抑制IDE來增強胰島素的活性[34]。ACSL1的高表達通過PPARβ途徑減少脂肪酸γ氧化，參與甘油三酯生物合成及脂肪酸代謝通路從而提高甘油三酯水平，ACSL1下調后甘油三酯水平下降[35]，已證實靜脈滴注ANP 45 min后血漿中甘油三酯水平有降低趨勢[7]?？赡苡捎诒狙芯繘]有直接評估蛋白質表達水平，也沒有直接評估脂肪酸通量，相對的基因表達量并不一定意味著蛋白質將被翻譯或具有功能。因此，后續的研究應該同時測量蛋白質水平和脂代謝基因的活性。

4 結 論

4.1靜脈滴注ANP后，阿勒泰羊血漿中ANP、脂聯素、cGMP、胰島素和瘦素含量均有不同程度的增加，ANP在一定程度上促進了阿勒泰羊的脂肪動員，增加了脂肪分解。

4.2靜脈滴注ANP后尾脂組織中有1 482個基因上調，2 204個基因下調；GO富集分析顯示，差異基因主要富集在氧化磷酸化相關的生物過程；KEGG富集分析顯示，差異基因主要富集在核糖體、產熱、氧化磷酸化和調節脂肪細胞中的脂肪分解等信號通路上。表明外源ANP通過增加氧化磷酸化和產熱促進脂肪分解。