基于Label-free技術(shù)比較馬和驢血清蛋白質(zhì)組分差異

張鏻兮，韓雨薇，李 政，廖清超，湯 馳，鄧 亮

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866)

馬和驢雖同屬于馬屬動(dòng)物，但遺傳特征、生理和行為特點(diǎn)等多方面存在差異。血液是動(dòng)物機(jī)體的一種重要體液，研究顯示，馬與驢的血紅蛋白結(jié)構(gòu)和凝血類(lèi)型均有所區(qū)別[1-3]。驢的紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞壓積和血清總膽紅素水平顯著比馬的低，而驢的平均紅細(xì)胞體積和血清甘油三酯水平顯著高于馬[4-5]。馬和驢的血清/血漿中含有約7%的蛋白質(zhì)[6]，這些蛋白質(zhì)來(lái)源于機(jī)體的各種細(xì)胞和組織，發(fā)揮著維持血液的正常滲透壓、黏度和酸堿度以及免疫調(diào)節(jié)等重要功能，能夠直接反映機(jī)體的生理和病理狀態(tài)。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是近年來(lái)生命科學(xué)領(lǐng)域興起的重要研究手段之一，利用該技術(shù)可以對(duì)血清/血漿蛋白質(zhì)組成特征進(jìn)行詳細(xì)分析，能夠有效推動(dòng)新的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)，利于提高疾病臨床診斷效率[7]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已在馬屬動(dòng)物的血清/血漿蛋白質(zhì)組研究中取得一定進(jìn)展。以往研究利用雙向凝膠電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)方法建立了馬血清蛋白質(zhì)圖譜[8-9]，評(píng)估了馬耐力運(yùn)動(dòng)前后血漿蛋白質(zhì)的特征變化[10]。Han等[11]使用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法揭示了健康驢血清蛋白質(zhì)組成特征，但關(guān)于馬和驢血清蛋白質(zhì)組成的精確特征差異仍不清楚。

本研究應(yīng)用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)馬和驢血清蛋白質(zhì)組成差異進(jìn)行詳細(xì)比較分析，旨在探究馬屬動(dòng)物血清蛋白質(zhì)生物學(xué)特征，為進(jìn)一步揭示馬屬動(dòng)物種間生理特征差異和有效保障健康提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)在遼寧省大連市某集約化養(yǎng)殖場(chǎng)，根據(jù)體況評(píng)分與獸醫(yī)檢查記錄，選擇9匹蒙古馬和9頭 遼西驢[12]，雌性，年齡4～10歲，均處于正常發(fā)情周期的間情期，健康無(wú)病、精神狀態(tài)及采食狀況良好。馬和驢分別提供相同的飼養(yǎng)條件，日糧由玉米秸稈、谷草、玉米、麩皮、豆粕、礦物質(zhì)、維生素和水組成，每日分3次飼喂。血液樣品在上午9:00—10:00點(diǎn)采集，每個(gè)個(gè)體采集1次。采用頸靜脈采血方式，使用10 mL無(wú)抗凝劑真空管(BD Vacutainer，美國(guó))收集血液。在4 ℃以3 000×g離心10 min以分離血清，無(wú)黃疸、溶血、脂血現(xiàn)象發(fā)生，血清于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

裂解液、SDS(十二烷基硫酸鈉)、DTT(二硫蘇糖醇)、Tris-HCl(三氨基甲烷鹽酸鹽)、蛋白酶抑制劑、碳酸氫銨(NH4HCO3)、甲酸、乙腈、氨水、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素(UA)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)。

1.3 血清蛋白質(zhì)提取

為了避免個(gè)體差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，將馬和驢的各9份血清樣品分別隨機(jī)分成3組，每組內(nèi)的3份血清樣品均勻混合成1個(gè)生物學(xué)重復(fù)，從而馬和驢各獲得3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的血清樣品(馬為H1、H2、H3，驢為D1、D2、D3)。

每個(gè)血清樣品中加入1 mL裂解液(4% SDS，100 mmol·L-1DTT，100 mmol·L-1Tris-HCl)裂解，對(duì)應(yīng)加入1%體積蛋白酶抑制劑，混勻。4 ℃下2 000×g·min-1離心40 min，取上清液。使用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量，-80 ℃保存。

1.4 血清蛋白質(zhì)酶解

每個(gè)樣品各取300 μg，加入終濃度為100 mmol·L-1DTT，沸水浴5 min，冷卻至室溫后迅速加入200 μL UA緩沖液混勻，轉(zhuǎn)入10 ku 超濾離心管中，12 000×g 離心15 min，棄濾液，再按相同條件重復(fù)離心并過(guò)濾一次。加入100 μL 50 mmol·L-1的IAA緩沖液，600×g振蕩1 min，室溫避光孵育30 min，12 000×g離心 10 min。加入100 μL UA緩沖液，12 000×g 離心10 min，重復(fù)離心兩次。加入100 μL NH4HCO3緩沖液，1 400×g 離心10 min，重復(fù)離心兩次。加入40 μL胰蛋白酶緩沖液(胰蛋白酶：NH4HCO3緩沖液=3 μg: 20 μL)，600×g振蕩1 min，37 ℃孵育16～18 h。換新收集管，12 000×g離心 10 min，收集濾液，加入適量0.1% TFA，酶解后的肽段使用C18 小柱脫鹽，真空凍干。酶解后的肽段干燥后用0.1%甲酸溶液復(fù)溶，肽段濃度測(cè)定，以備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.5 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析血清蛋白質(zhì)組分

酶解產(chǎn)物采用納升流速Easy nLC 1 200色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。每個(gè)樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到捕集柱C18 trap column(100 μm×20 mm×5 μm)，再經(jīng)過(guò)分析柱C18 column(75 μm×150 mm×3 μm)分離，色譜柱以95%的A液平衡，流速為300 nL·min-1。相關(guān)液相梯度：前2 min，B液線性梯度從5%到8%；90 min，B液線性梯度從8%到23%；100 min，B液線性梯度從23%到40%；108 min，B液線性梯度從40%到100%；最后12 min，B液維持在100%。酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后，Q-Exactive Plus質(zhì)譜儀(Thermo Scientific)進(jìn)行質(zhì)譜分析。過(guò)柱時(shí)長(zhǎng)120 min，離子化后均帶一個(gè)單位正電荷；母離子掃描范圍：300～1 800 m·z-1。

1.6 血清蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與鑒定

使用Max Quant 1.6.0.16軟件對(duì)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，先對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭測(cè)序計(jì)算，然后再進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。參數(shù)設(shè)置：酶解蛋白為胰蛋白酶；固定修飾選擇烷基化修飾，可變修飾為氧化修飾和乙?；揎?；母離子質(zhì)量數(shù)最大容許誤差范圍為±20.0 ppm；數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniprot，物種為Equuscaballus(馬)和Equusasinus(驢)；FDR值<1%，并至少含有1個(gè)以上肽段的蛋白質(zhì)為成功鑒定蛋白質(zhì)。

1.7 血清差異蛋白質(zhì)篩選及功能分析

應(yīng)用R語(yǔ)言等生物信息學(xué)分析軟件對(duì)馬和驢血清中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。當(dāng)差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍及以上(即上調(diào)≥1.5倍和下調(diào)≤0.66倍)，且經(jīng)過(guò)顯著性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其P值≤0.05時(shí)，才認(rèn)定為顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過(guò)Perseus[13]軟件對(duì)顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO(gene ontology)功能富集分析。利用KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)pathway數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)信號(hào)通路富集分析。STRING(http://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。

2 結(jié) 果

2.1 馬和驢血清蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

通過(guò)BCA法結(jié)合酶標(biāo)儀測(cè)定樣品吸光值，并計(jì)算出血清樣品蛋白質(zhì)濃度。馬的血清樣品中H1蛋白質(zhì)濃度最高，為12.49 μg·μL-1，H3蛋白質(zhì)濃度最低，為11.54 μg·μL-1；驢的血清樣品中D2蛋白質(zhì)濃度最高，為14.19 μg·μL-1，D3蛋白質(zhì)濃度最低，為12.30 μg·μL-1，如表1所示。

表1 馬和驢血清樣品蛋白質(zhì)濃度

2.2 馬和驢血清蛋白質(zhì)鑒定

馬和驢的血清中共鑒定出361種蛋白質(zhì)，其中馬的血清中鑒定出288種蛋白質(zhì)，分子量范圍為1.52～511.24 ku；驢的血清中鑒定出244種蛋白質(zhì)，分子量范圍為1.53～611.47 ku；馬和驢血清中鑒定出的相同蛋白質(zhì)有171種。在鑒定出的361種蛋白質(zhì)中，有121種蛋白質(zhì)的分子量范圍為10～30 ku，96種為30～50 ku，55種為50～70 ku，40種為70～100 ku，33種大于100 ku以及16種小于10 ku(圖1)。

圖1 鑒定出的血清蛋白質(zhì)分子量分布

2.3 馬和驢血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)

對(duì)鑒定出的蛋白質(zhì)進(jìn)行差異表達(dá)分析，共獲得231種顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)(fold change≥1.5,P≤0.05)，驢比馬上調(diào)的血清蛋白質(zhì)有99種，驢比馬下調(diào)的血清蛋白質(zhì)有132種。231種顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，109種蛋白質(zhì)僅在馬血清中特異表達(dá)，69種 蛋白質(zhì)僅在驢血清中特異表達(dá)。

2.4 馬和驢血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.4.1 GO功能分析 GO對(duì)基因功能進(jìn)行分類(lèi)，共涵蓋3個(gè)基因本體，分別為生物學(xué)過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)。差異表達(dá)蛋白質(zhì)共涉及到的生物學(xué)過(guò)程如圖2所示。差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括蛋白質(zhì)激活(protein activation cascade)、補(bǔ)體激活(complement activation)、免疫應(yīng)答(immune response)、凝血(blood coagulation)以及脂蛋白氧化調(diào)控(regulation of lipoprotein oxidation)等過(guò)程；細(xì)胞組分方面，差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要定位于胞外區(qū)域(extracellular region)、胞外區(qū)域部分(extracellular region part)、細(xì)胞外泌體(extracellular exosome)、胞外囊泡(extracellular vesicle)和胞外細(xì)胞器(extracellular organelle)等；差異表達(dá)蛋白質(zhì)的分子功能有糖蛋白結(jié)合(glycoprotein binding)、細(xì)胞外結(jié)合基質(zhì)蛋白(extracellular matrix binding)、poly—A-RNA結(jié)合(poly(A)RNA binding)、MHCⅡ類(lèi)蛋白復(fù)合體結(jié)合(MHC class II protein complex binding)、糖胺聚糖結(jié)合(glycosaminoglycan binding)、肽聚糖結(jié)合(peptidoglycan binding)和果糖結(jié)合(fructose binding)等。

圖2 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能富集分析

2.4.2 KEGG通路分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路分析表明，差異表達(dá)蛋白質(zhì)共涉及到14條通路，根據(jù)顯著差異P值排序前10條通路見(jiàn)圖3。富集最顯著的通路為補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)(complement and coagulation cascades)，吞噬體(phagosome)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum)，抗原加工遞呈(antigen processing and presentation)，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝(glycine, serine and threonine metabolism)，癌癥蛋白多糖(proteoglycans in cancer)等。

圖3 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG通路富集分析

2.5 馬和驢血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)互作分析

利用STRING軟件對(duì)鑒定出的231種血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果如圖4所示?；プ骶W(wǎng)絡(luò)被用來(lái)表示差異表達(dá)蛋白質(zhì)之間的生物交聯(lián)，球形代表輸入的差異蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)間的關(guān)聯(lián)用線形表示，連線越多，代表該蛋白質(zhì)處于相對(duì)重要的位置或該蛋白質(zhì)的研究相對(duì)較多。血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)緊密相連富集最為顯著的功能模塊主要為代謝途徑、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)、吞噬體，且這3個(gè)模塊與KEGG注釋結(jié)果重疊，表明馬和驢在其功能上的差異。大部分蛋白質(zhì)至少與其中一個(gè)蛋白質(zhì)存在相互作用，HSP90AA1、HSPA8、APOD、APOM、SERPING1、MASP1、CALR、TUBA1B、TUBB等處在關(guān)系互作網(wǎng)的重要節(jié)點(diǎn)。

圖4 血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

本研究應(yīng)用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較了馬和驢血清蛋白質(zhì)組成特征差異，共鑒定出231種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為今后深入研究馬屬動(dòng)物種間生理特征差異提供了一定理論基礎(chǔ)。前期研究應(yīng)用雙向凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOF MS等方法，表明馬的不同品種之間[14]、馬屬動(dòng)物不同物種之間的血清蛋白質(zhì)組分具有不同特征。馬和驢雜交形成的馬騾，血清蛋白質(zhì)組成特征更接近于驢[15]。Label-free 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，即光譜計(jì)數(shù)，根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜相關(guān)的每個(gè)蛋白質(zhì)鑒定到的肽段總次數(shù)和所鑒定肽段的離子價(jià)位等信息進(jìn)行定量分析，是一種相對(duì)更為精確的高通量蛋白質(zhì)組分定量分析方法[16]。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是一類(lèi)在哺乳動(dòng)物中廣泛存在的內(nèi)源性保護(hù)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)家族在引導(dǎo)新生蛋白質(zhì)的初始折疊和部分變性結(jié)構(gòu)的重折疊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損害[17-18]。HSP90和HSPA是熱休克蛋白家族中兩個(gè)高度保守的依賴(lài)ATP的分子伴侶，在遇到外界不利因素刺激和環(huán)境變化時(shí)主要通過(guò)促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成和改變其空間結(jié)構(gòu)來(lái)保護(hù)機(jī)體，直接或間接參與腫瘤的發(fā)生、免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)、傷口愈合、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)運(yùn)、生殖細(xì)胞活性調(diào)節(jié)等過(guò)程[19]。本研究結(jié)果顯示，HSP90和HSPA8僅在馬血清中特異性表達(dá)，且這兩個(gè)蛋白質(zhì)顯著富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工和抗原加工遞呈等通路中，揭示驢對(duì)外界環(huán)境的刺激反應(yīng)可能沒(méi)有馬強(qiáng)烈。事實(shí)上，與馬相比，驢對(duì)疼痛的反應(yīng)和疾病臨床癥狀表現(xiàn)相對(duì)不明顯[20]，因此生產(chǎn)中更應(yīng)注重對(duì)驢的健康管理。

脂蛋白(lipocalin)超家族是一類(lèi)可以結(jié)合和運(yùn)輸各種外源性和內(nèi)源性配體的蛋白質(zhì)。其中，載脂蛋白D(apolipoprotein D, APOD)是一種糖基化蛋白質(zhì)，作為高密度脂蛋白的組成部分與脂質(zhì)代謝和神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)。APOD主要參與脂質(zhì)運(yùn)輸、食物攝取、炎癥、抗氧化反應(yīng)和發(fā)育以及在不同類(lèi)型癌癥中發(fā)揮作用[21-23]。載脂蛋白M(apolipoprotein M，APOM)是一種新型的抗動(dòng)脈粥樣硬化蛋白質(zhì)，主要存在于高密度脂蛋白(HDL)和微量低密度脂蛋白(LDL)中。研究表明，載脂蛋白通過(guò)逆轉(zhuǎn)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)在HDL代謝中發(fā)揮重要作用，對(duì)LDL氧化和動(dòng)脈粥樣硬化具有保護(hù)作用[24-25]。APOM還與高脂血癥有關(guān)[26]。研究發(fā)現(xiàn)，驢的血脂異常比馬更為常見(jiàn)[27]。本研究結(jié)果表明APOD和APOM在驢血清中的表達(dá)量顯著高于馬，且主要參與脂蛋白氧化調(diào)控以及免疫系統(tǒng)反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，可能與驢比馬更易患高血脂癥有關(guān)，因此生產(chǎn)中更應(yīng)注意驢對(duì)脂類(lèi)物質(zhì)的代謝調(diào)控與管理。

甘露聚糖結(jié)合凝集素絲氨酸肽酶1(mannan-binding lectin serine peptidase 1, MASP1)是補(bǔ)體系統(tǒng)中的核心蛋白酶之一，是凝集素途徑激活所必需的。據(jù)報(bào)道，MASP1可以增加促炎細(xì)胞因子(如IL-6和IL-8)的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)趨化作用，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的功能。補(bǔ)體凝集素與中性粒細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的協(xié)同作用可能是增強(qiáng)抗微生物免疫應(yīng)答的有效途徑。MASP1可能也參與了百日咳等疾病過(guò)程[28]。絲氨酸G家族成員1(serpin family G member 1, SERPING1)是一種蛋白酶抑制劑，屬于絲氨酸蛋白酶家族，其中心功能是通過(guò)抑制其亞成分C1R和C1S的蛋白水解活性來(lái)調(diào)節(jié)C1，從而對(duì)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)有下游效應(yīng)。功能失調(diào)的SERPING1阻止了C1補(bǔ)體系統(tǒng)的自動(dòng)激活，并減弱了纖溶酶、激肽釋放酶和凝血因子X(jué)IIa、XIIf和XIa等酶類(lèi)的產(chǎn)生[29]。本研究結(jié)果顯示，MASP1和SERPING1顯著富集在補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)通路中，兩者在驢血清中的表達(dá)水平顯著高于馬，表明驢可能具有更強(qiáng)的免疫耐受機(jī)能。

鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin, CALR)是一種多功能蛋白質(zhì)，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)糖蛋白折疊和鈣穩(wěn)態(tài)，以及細(xì)胞增殖、吞噬和凋亡等功能[30]。微管蛋白(tubulin)是構(gòu)成微管的結(jié)構(gòu)單元，是細(xì)胞骨架的主要成分，對(duì)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、染色體分離和細(xì)胞遷移等許多細(xì)胞過(guò)程發(fā)揮重要作用[31]。微管蛋白包括α-、β-、γ-、δ-和ε-共5種不同形式的成員。微管蛋白α1b(tubulin alpha-1D chain, TUBA1B)，也稱(chēng)為K-ALPHA-1，是一種蛋白質(zhì)編碼基因[32]。I級(jí)微管蛋白(tubulin beta class I, TUBB)是β-微管蛋白編碼基因之一，在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和皮膚中廣泛表達(dá)[33]。本研究結(jié)果顯示，CALR廣泛富集于吞噬體、抗原加工遞呈和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路中，TUBA1B和TUBB在吞噬體通路中顯著富集。這幾種差異表達(dá)蛋白質(zhì)都在馬血清中特異表達(dá)，推測(cè)這可能與馬和驢免疫調(diào)節(jié)差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究應(yīng)用 Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析比較了馬和驢血清蛋白質(zhì)組分差異。從馬和驢血清中共鑒定出231種差異表達(dá)蛋白質(zhì)，驢比馬上調(diào)的血清蛋白質(zhì)有99種，驢比馬下調(diào)的血清蛋白質(zhì)有132種。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)具有明顯的相互作用，主要參與了補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)過(guò)程，并參與多種生物學(xué)途徑，表明馬和驢在生理?xiàng)l件下的血清蛋白質(zhì)組成特征存在一定差異。綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果為研究馬和驢的血清蛋白質(zhì)組學(xué)特征提供了新的視角。該研究為進(jìn)一步揭示馬屬動(dòng)物種間生理特征差異和有效保障其健康提供數(shù)據(jù)支撐。