天麻素對(duì)兔坐骨神經(jīng)擠壓傷修復(fù)作用探究

張賢平， 陳菲菲， 張 衡， 陳俊毅， 王銳英， 何 鵬， 高 峰， 黃昌釗

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 桂林 541000)

近年來(lái)，周圍神經(jīng)損傷的病例數(shù)逐年增加，相關(guān)的診治成為了一大熱點(diǎn)及難點(diǎn)。手術(shù)的修復(fù)只是為神經(jīng)再生提供了基礎(chǔ)，人們還采取各種方法促進(jìn)后續(xù)的功能恢復(fù)，其中藥物首當(dāng)其沖[1]。如今臨床上常用的藥物有各類神經(jīng)生長(zhǎng)因子，但是其昂貴的價(jià)格難以成為患者的首選。本實(shí)驗(yàn)以家兔用鉗夾法[2]造模，模擬人周圍神經(jīng)擠壓傷，以期探索天麻素對(duì)外周神經(jīng)擠壓傷的療效及對(duì)神經(jīng)損傷的修復(fù)作用，為臨床治療周圍神經(jīng)損傷提供新的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只健康雄性新西蘭白兔(編號(hào)1107261911000699，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXX(湘)2019-0015；級(jí)別為普通級(jí))，體質(zhì)量1.5～2 kg，平均1.8 kg，由長(zhǎng)沙市天勤生物科技有限公司提供，已經(jīng)過(guò)桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查。

分組，將40只實(shí)驗(yàn)兔采用隨機(jī)數(shù)字表的方法分為模型對(duì)照組(生理鹽水5 mL/kg)、天麻素低劑量組(200 mg/kg肌注)、天麻素高劑量組(400 mg/kg肌注)、陽(yáng)性藥組(甲鈷胺0.5 μg/kg肌注)，每組10只，分籠專人飼養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 天麻素注射液(中國(guó)陜西博森生物制藥有限公司，批號(hào)20099312)。甲鈷胺注射液(中國(guó)衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，批號(hào)396200652)；注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥六廠，批號(hào)0171909310)；GAP43 抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)33-5000)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ZB-2301)；免疫熒光二抗(美國(guó)Affinity公司，貨號(hào)S0017)。

1.3 儀器 16 cm全齒血管彎鉗(上海鑫閔生物科技有限公司)；石蠟切片機(jī)、超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；分析天平、游標(biāo)卡尺(北京第二精密量具廠)；Biolap98智能型生物信號(hào)系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模 以3.6%水合氯醛(10 mL/kg)沿兔耳緣靜脈注射麻醉后，將兔子呈俯臥位固定。依次備皮，消毒，鋪巾。從髂后上棘下縱行切開(kāi)實(shí)驗(yàn)兔左大腿后外側(cè)皮膚,逐層分離肌肉，找到并暴露坐骨神經(jīng),在距梨狀肌下緣約1.5 cm處用塑料膜覆蓋的16 cm全齒血管彎鉗的尖端鎖致全扣夾住神經(jīng)5 min，可見(jiàn)神經(jīng)纖維變薄但未離斷。在夾傷處神經(jīng)外膜用8-0顯微外科縫線做1標(biāo)記，然后用3-0絲線逐層縫合皮膚，碘伏消毒，包扎傷口。術(shù)后繼續(xù)分籠專人飼養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)3 d予注射青霉素鈉及碘伏消毒傷口預(yù)防感染，7 d后拆除縫線。

2.2 給藥與飼養(yǎng) 造模成功后，低劑量組予天麻素200 mg/kg，高劑量組予天麻素400 mg/kg，陽(yáng)性藥組予肌注甲鈷胺注射液50 μg/kg，模型對(duì)照組予0.9%氯化鈉注射液5 mL/kg。連續(xù)給藥4周，期間動(dòng)物由專人喂養(yǎng)，喂養(yǎng)條件相同。

2.3 檢查方法與指標(biāo)

2.3.1 大體觀察 術(shù)后每日觀察實(shí)驗(yàn)兔的步態(tài)，傷口愈合情況，是否感染；是否出現(xiàn)自嗜現(xiàn)象；足趾與足底是否有潰瘍，肌肉萎縮情況。

2.3.2 坐骨神經(jīng)功能評(píng)分 ①趾張反射，提起實(shí)驗(yàn)兔頸部皮膚，使其下落卻不著地。正常兔的反應(yīng)為放射性腳趾打開(kāi)，而坐骨神經(jīng)受損的表現(xiàn)則減弱甚至消失。以腳趾開(kāi)合程度分級(jí)為1級(jí), 腳趾完全沒(méi)分開(kāi)；2級(jí), 稍微分開(kāi)；3級(jí), 明顯分開(kāi), 但低于傷前水平；4級(jí), 恢復(fù)至傷前水平，分別記1～4分。②改良Tarlov評(píng)分，0級(jí), 肢體完全癱瘓, 對(duì)針刺無(wú)反應(yīng)；1級(jí), 針刺僅可見(jiàn)有輕微反應(yīng)；2級(jí), 損傷側(cè)后肢所有關(guān)節(jié)有自主運(yùn)動(dòng), 但不存在抵抗能力；3級(jí), 具有抵抗手壓能力, 步態(tài)仍不穩(wěn)；4級(jí), 步態(tài)恢復(fù)至傷前水平，分別記0～4分。以上2項(xiàng)之和為每只實(shí)驗(yàn)兔的坐骨神經(jīng)功能評(píng)分。

2.3.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢查 術(shù)后第1、2、3、4周將實(shí)驗(yàn)兔麻醉后暴露患側(cè)坐骨神經(jīng)，使用Biolap98智能型生物信號(hào)顯示與處理系統(tǒng)進(jìn)行電生理檢測(cè)，使用游標(biāo)卡尺計(jì)算兩電極間的距離，記錄傳導(dǎo)時(shí)間，計(jì)算神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

2.3.4 組織學(xué)檢查 術(shù)后第4周取實(shí)驗(yàn)兔坐骨神經(jīng)鉗夾處神經(jīng)標(biāo)本，進(jìn)行常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE staining)，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理情況及拍照。

2.3.5 靶肌肉恢復(fù)率 處死實(shí)驗(yàn)兔后完整取下兩側(cè)小腿三頭肌并稱定質(zhì)量，計(jì)算其恢復(fù)率(恢復(fù)率=患側(cè)肌濕重/健側(cè)肌濕重×100%)。

2.3.6 神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)及累計(jì)吸光度 處死后取各組實(shí)驗(yàn)兔坐骨神經(jīng)受損處橫斷面，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作行GAP-43免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，用Image Plus 6.0進(jìn)行累吸光度分析。

3 結(jié)果

3.1 大體觀察 手術(shù)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)兔因麻醉死亡3只，補(bǔ)齊后實(shí)驗(yàn)順利。術(shù)后各組兔子未見(jiàn)明顯感染跡象。術(shù)后個(gè)別實(shí)驗(yàn)兔傷口出現(xiàn)潰瘍情況，少部分出現(xiàn)自嗜現(xiàn)象。模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔傷口處潰瘍較其余組大，自嗜現(xiàn)象更為嚴(yán)重。術(shù)后1周實(shí)驗(yàn)兔肌力差，刺激無(wú)明顯反應(yīng)，后肢拖地現(xiàn)象嚴(yán)重，四組之間未見(jiàn)明顯差異；術(shù)后第2周，模型對(duì)照組和低劑量組未見(jiàn)明顯好轉(zhuǎn)，高劑量組和陽(yáng)性藥組實(shí)驗(yàn)兔肌力有所恢復(fù)，偶見(jiàn)縮足與舔足行為，但仍有跛足現(xiàn)象；術(shù)后4周高劑量組和陽(yáng)性藥組組實(shí)驗(yàn)兔步態(tài)較前明顯好轉(zhuǎn)，手握其后腿感受后蹬力明顯強(qiáng)勁，刺激反應(yīng)也更加明顯，見(jiàn)圖1～2。

圖1 術(shù)后1周開(kāi)始模型對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔出現(xiàn)嚴(yán)重的自嗜現(xiàn)象

注：模型對(duì)照組和低劑量組可見(jiàn)受損神經(jīng)菲薄，外膜出血現(xiàn)象仍明顯。高劑量組和陽(yáng)性藥組可見(jiàn)受損神經(jīng)近乎正常形態(tài)，外膜血腫也基本消退，但仍然可見(jiàn)局部粘連。

3.2 坐骨神經(jīng)功能評(píng)分 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)趾張反射與改良Tarlov評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行了客觀的評(píng)分及統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出了坐骨神經(jīng)功能評(píng)分值，可見(jiàn)高劑量和陽(yáng)性藥組評(píng)分在各個(gè)時(shí)間段均優(yōu)于模型對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，而低劑量組在各個(gè)時(shí)間段較模型對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組實(shí)驗(yàn)兔的坐骨神經(jīng)指數(shù)

3.3 神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè) 術(shù)后第1、2、3、4周分別將各組實(shí)驗(yàn)兔麻醉后暴露患側(cè)坐骨神經(jīng)，以Biolap98生物信號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)速度檢測(cè)。結(jié)果顯示，在4個(gè)時(shí)間段，高劑量組和陽(yáng)性藥組神經(jīng)傳導(dǎo)速度均大于模型對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，低劑量組與模型對(duì)照組比較無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 電生理統(tǒng)計(jì)圖

3.4 組織病理學(xué)檢查 術(shù)后4周取各組實(shí)驗(yàn)兔左側(cè)坐骨神經(jīng)沿神經(jīng)長(zhǎng)軸切片行HE染色，于光鏡下觀察顯示，高劑量組和陽(yáng)性藥組神經(jīng)損傷處神經(jīng)纖維排列較整齊且致密，雪旺細(xì)胞增殖較多，模型對(duì)照組和低劑量組神經(jīng)纖維排列凌亂切疏松，且雪旺細(xì)胞較少，炎癥細(xì)胞較多，見(jiàn)圖3。

圖3 4周后處死實(shí)驗(yàn)兔取得坐骨神經(jīng)行HE染色結(jié)果(×40，標(biāo)尺50 μm)

3.5 靶肌肉恢復(fù)率 處死實(shí)驗(yàn)兔后完整取下其兩側(cè)小腿三頭肌，計(jì)算其靶肌肉恢復(fù)率，得出高劑量組和陽(yáng)性藥組恢復(fù)率均大于模型對(duì)照組(P<0.05)，低劑量組較模型對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3 靶肌肉恢復(fù)率

3.6 神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)水平及累計(jì)吸光度 4周后處死取各組實(shí)驗(yàn)兔坐骨神經(jīng)受損處橫斷面，行GAP-43免疫熒光染色并進(jìn)行累計(jì)吸光度分析，可見(jiàn)，高劑量組和陽(yáng)性藥組組神經(jīng)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)量遠(yuǎn)多于模型對(duì)照組，低劑量組相較模型對(duì)照組卻無(wú)明顯差異。累計(jì)吸光度高劑量組和陽(yáng)性藥組均高于模型對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，低劑量組對(duì)比模型對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)，見(jiàn)圖4～5。

圖4 受損神經(jīng)橫斷面GAP-43免疫熒光染色(×100)

注：與模型對(duì)照組比較，#P<0.05,##P<0.01。

4 討論

神經(jīng)擠壓傷是臨床傷常見(jiàn)的致殘性疾病，常由外傷、腫瘤壓迫、炎癥等所致。本實(shí)驗(yàn)所采取的神經(jīng)鉗夾傷是目前被廣泛認(rèn)可且被應(yīng)用的一種造模方法，很好地模擬了人周圍神經(jīng)擠壓傷的病理生理，主要表現(xiàn)為損傷后軸索斷裂，而神經(jīng)外膜，內(nèi)膜及束膜依舊保持著連續(xù)性，神經(jīng)傳導(dǎo)軸漿流經(jīng)過(guò)受損處時(shí)受阻，神經(jīng)傳導(dǎo)速度即下降[3]。隨后鈣離子聚集，激活相關(guān)的蛋白酶，導(dǎo)致受損部位髓鞘崩解，發(fā)生脫髓鞘反應(yīng)。接著炎性細(xì)胞聚集，吞噬崩解產(chǎn)物[4]。起到關(guān)鍵因素的雪旺細(xì)胞開(kāi)始增殖，它一方面協(xié)助吞噬細(xì)胞清理破裂的軸突碎片，另一方面形成為Bungner帶，為新生的軸突“搭橋”，同時(shí)還分泌各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子[5]。然后，新生軸芽沿著B(niǎo)ungner帶通向靶器官，再次髓鞘化，神經(jīng)得到新生[6]。

天麻素為天麻的主要有效成分之一，被廣泛運(yùn)用于治療頭痛、癲癇、頭暈等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]，在現(xiàn)代藥理學(xué)中，天麻素被證明了具有保護(hù)神經(jīng)元與抗氧化性損傷的功效[8-15]，同時(shí)能降低炎性因子的表達(dá)[16-19]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的運(yùn)用中已較為廣泛。近年來(lái)在對(duì)周圍神經(jīng)損傷的研究中，天麻素被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖[20]，還可以刺激腦源性生長(zhǎng)因子的分泌[21]。甲鈷胺是現(xiàn)在臨床上常見(jiàn)的用于治療周圍神經(jīng)損傷的藥物，將其作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性藥物作為對(duì)比。在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前本實(shí)驗(yàn)組就天麻素的用量進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置了100、200、400、800 mg/kg梯度劑量組，結(jié)果顯示最低劑量組療效甚微，而最高劑量組出現(xiàn)了數(shù)只實(shí)驗(yàn)兔精神狀況萎靡，進(jìn)食差甚至死亡的情況，考慮為藥物濃度過(guò)大所致，因此本實(shí)驗(yàn)天麻素選擇的劑量梯度為200、400 mg/kg。通過(guò)組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)天麻素高劑量組及陽(yáng)性藥組受損神經(jīng)處炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少，雪旺細(xì)胞增殖更甚及新生軸突較多且排列更致密；電生理是反應(yīng)神經(jīng)功能恢復(fù)的客觀指標(biāo)，其結(jié)果也同樣顯示高劑量組的神經(jīng)傳導(dǎo)速度較優(yōu)，這意味著受損部位的軸索得到了相對(duì)較好的修復(fù)；小腿三頭肌作為坐骨神經(jīng)的靶肌肉，其恢復(fù)率也表明支配其的坐骨神經(jīng)功能得到了改善；GAP-43作為周圍神經(jīng)損傷后再連接的標(biāo)志性蛋白可以很好地反應(yīng)神經(jīng)的修復(fù)與新生，天麻素高劑量組及陽(yáng)性藥組的免疫熒光及吸光度皆優(yōu)于低劑量及模型對(duì)照組，意味著前者對(duì)受損神經(jīng)的再生起著良好的推動(dòng)作用；同時(shí)也觀察到了隨著治療，高劑量組的實(shí)驗(yàn)兔在行為學(xué)上的表現(xiàn)也有顯著的好轉(zhuǎn)。通過(guò)以上結(jié)果可以表明一定劑量的天麻素對(duì)損傷后多種因素的正向調(diào)節(jié)促進(jìn)著神經(jīng)的修復(fù)。

本實(shí)驗(yàn)證明了天麻素對(duì)實(shí)驗(yàn)兔神經(jīng)擠壓傷的恢復(fù)具有積極意義，并且有著一定的量效關(guān)系。天麻素作為中藥提取物，有著不良反應(yīng)小，吸收與代謝較快并且價(jià)格較為低廉的特點(diǎn)，相信隨著進(jìn)一步的研究，這些特點(diǎn)可能會(huì)成為天麻素在治療周圍神經(jīng)損傷領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)所在。但是天麻素促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)地分子機(jī)制還尚不明確，這也是本課題組下一步會(huì)努力的方向。