基于質量常數法和化學計量學的黃芪等級評價

司明東， 李新蕊， 李亞楠， 鄭玉光,2， 馬東來,2*， 李 菁*

(1.河北中醫學院 藥學院，河北 石家莊 050200；2.河北省中藥炮制技術創新中心，河北 石家莊 050091)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]，始載于《神農本草經》，列為上品，其味甘、性溫，有“補氣固表之圣藥”之稱[2-3]。黃芪富含皂苷、多糖、黃酮、氨基酸、亞油酸等多種活性成分，其中黃芪皂苷和黃酮類是主要藥理有效成分群，有多種藥理作用[4-6]。

黃芪屬于藥食同源的中藥材，隨著黃芪有效成分的深入研究，其在臨床和保健品市場需求量急劇增加[7]，但黃芪市場質量參差不齊，質量堪憂，如何規范黃芪質量等級評價，促進行業發展成為中藥行業研究熱點。中藥飲片的等級劃分能夠有效起到中藥材優質優價效果，傳統“辨狀論質”僅通過藥材的外觀、顏色、霉變情況、蟲蛀、色澤等進行等級評價，如《七十六種藥材商品規格標準》[8]。除藥材本身性狀特征外，其內在有效成分也是評價藥材質量的關鍵指標。

本課題組已經利用中藥質量常數評價方法完成了種子類藥材酸棗仁的等級劃分[9]。本次實驗對市場或飲片企業收集的28批黃芪藥材的直徑、厚度和質量進行測量，并利用高效液相色譜檢測黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，通過中藥質量常數法建立黃芪藥材等級劃分標準，同時采用偏最小二乘判別法和主成分分析法等化學計量方法進行驗證并篩選出重要特征因子。通過對黃芪藥材等級劃分研究，有利于規范黃芪藥材市場，實現優質優價，使黃芪藥材產業健康發展。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；ME204E型電子天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；KQ-250DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芪甲苷(批號C14J9Q65734)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(批號R11O9F71937)對照品均購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98.0%。乙腈、甲酸為色譜純，均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；水為自制超純水。

28批藥材購于安國、亳州中藥材市場和飲片企業，編號S1～S24、X1～X4(其中X1～X4為斜切)，具體信息見表1，經河北中醫學院鄭玉光老師鑒定為正品，標本保存于河北中醫學院生藥學標本室。

表1 藥材信息

2 方法與結果

2.1 指標成分含量測定

2.1.1 黃芪甲苷 參考文獻[1]，色譜條件為Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈-水(32∶68)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；漂移管溫度90 ℃；載氣體積流量2.9 L/min；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 黃芪甲苷HPLC色譜圖

精密移取204 μg/mL對照品溶液適量，甲醇稀釋至為25、50、75、125、150 μg/mL，在上述色譜條件下進樣測定3次。以黃芪甲苷峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=2 955.5X-839.09(r=0.999 9)。

取藥材(S1)粉末約4.0 g，精密稱定，加甲醇適量，索氏提取法提取4 h后濃縮提取液，加水10 mL，用正丁醇萃取40 mL，共4次，有機層用氨試液40 mL洗滌，共2次，有機層干燥后蒸干，殘渣加5 mL水溶解，取上清液，過D101型大孔吸附樹脂柱(內徑1.5 cm，柱高12 cm)，依次用50 mL純水、30 mL 40%乙醇、80 mL 70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液蒸干，甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。精密吸取20 μL注入液相色譜儀，測定黃芪甲苷含量。

2.1.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 參考文獻[1]，色譜條件為Thermo Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.2%甲酸(B)，梯度洗脫(0～20 min，20%～40% A；20～30 min，40%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。理論塔板數按毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計，應不低于3 000。色譜圖見圖2。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷HPLC色譜圖

精密移取199 μg/mL對照品溶液適量，甲醇稀釋至25、50、75、125、150 μg/mL，按上述色譜條件下進樣測定3次。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得回歸方程為Y=7 696.4X+1 799.7(r=0.999 7)。

取藥材(S1)粉末約1.0 g，精密稱定，精密加入50 mL甲醇，稱定質量，水浴回流4 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，減壓蒸干后甲醇溶解并定容于5 mL量瓶中，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得。精密10 μL注入液相色譜儀，測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。

2.2 形態參數測定 按照隨機原則從藥材中隨機抽取樣本，每批300片，分為3組，測定其直徑、厚度、質量，并計算平均半徑(r)、厚度(h)、質量(m)。

在游戲中，設計了多種游戲場景來考核學生的學習效果，例如：有任務場景、闖關場景、限時場景等。玩家在游戲中，可以自由選擇進入某一場景。通過在游戲中回答問題，獲得或失去一定分數。在游戲的過程中，如果玩家的分數低于指定的分值時，游戲即判斷玩家失敗。在游戲中為了提高學習效率，對于玩家回答錯誤的問題，會繼續出現在游戲中，而對于玩家回答正確的問題，則會被游戲屏蔽，而不再出現。以下圖2是一次玩家回答問題的圖示：

2.4 百分質量常數 將最大質量常數設成100%，其余飲片的百分質量常數計算公式為百分質量常數=(Ax/Amax)×100%，其中Ax為每批藥材質量常數，Amax為藥材最大質量常數。參考文獻[9,11]，以百分質量常數>80%的藥材為一等飲片，50%～80%為二等飲片，其余為三等飲片。

3 結果

3.1 指標成分含量

3.1.1 黃芪甲苷 在2015年版《中國藥典》規定，黃芪甲苷質量分數不得低于0.040%。在本實驗28批藥材中，該成分質量分數為0.035 6%～0.110 8%，差異較大，以S21最高，S10、S12、S15不符合藥典要求，見表2。

表2 28批藥材指標成分含量、形態參數、質量常數測定結果

3.1.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷 2015年版《中國藥典》規定，毛蕊異黃酮葡萄糖苷質量分數不得低于0.020%。在28批藥材中，該成分質量分數為0.020 0%～0.103 4%，均符合藥典規定，但差異較大，以S5最高，S7最低，見表2。

3.2 黃芪形態參數 表2、圖3顯示，28批藥材平均直徑為1.122～2.394 cm，差異較大，以X2最大，S14最小；平均厚度為0.331～0.438 cm，差異較小，以X1最厚，S13最薄；平均質量為0.184～0.848 g，差異較大，以X1最重，S15最輕。

圖3 28批藥材形態

3.4 化學計量學 在質量常數方法基礎上，采用SIMCA 13.0軟件進行系統主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)[13-14]，以藥材直徑、厚度、質量及黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為原變量，對28批藥材數據進行分析。

圖4顯示，初始特征值大于1的2個主成分累積貢獻率為92.37%，其中第一主成分為82.39%，第二主成分為9.98%，不同等級能較好地區分開。

圖4 藥材PCA分析圖

圖5顯示，藥材被很好地分為3個部分，與圖4一致，累積解釋能力參數R2X、R2Y分別為0.986、0.874，預測能力參數Q2為0.833，表示模型穩定性和預測能力較好。在0.95的置信區間內，選取VIP值>1.0的成分作為差異性指標，進一步對3個等級藥材數據的差異性進行整體分析，結果見表3，可知毛蕊異黃酮葡萄糖、平均直徑的VIP值均大于1。

表3 各指標VIP值

圖5 藥材OPLS-DA分析圖

上述結果表明，藥材劃分等級指標在化學成分和品質上具有一定差異性，也驗證了百分質量常數劃分黃芪等級的可行性，具體見表4。

表4 28批藥材實驗前后等級劃分比較

4 討論

傳統評價觀點認為“黃芪以外皮發白，內心發黃者為佳”，本研究從安國和亳州中藥材市場、飲片企業收集的28批黃芪樣品均符合傳統認識“外皮發白，內心發黃”，但由于其內在黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖含量較低，20批一等品(市場劃分等級)中有7批樣品按百分照質量常數分級中被列為二等，這可能與黃芪在種植過程中過度“管理”、生長年限、產地加工切制前浸泡過久等有關，野生品和栽培品種也存在一定差異，因而傳統藥材質量評價僅以黃芪外觀的粗細大小來判斷其等級是不夠科學的。本研究所用中藥質量常數等級評價方法是在傳統等級劃分基礎上，結合指標成分含量對藥材進行綜合性評價，利用黃芪藥材的直徑、厚度、質量、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量5個指標建立其百分質量常數等級劃分，其中各批次樣品間的百分質量常數在19.55%～100%，能夠較好分出黃芪藥材等級。最終的分級結果顯示28批黃芪樣品中一、二等藥材的平均直徑差異不大，三等藥材較一等藥材直徑小了近1倍，整體上分級結果也體現了直徑大者(生長年限較長)為佳的觀點，提示該方法選取合理，即能夠克服主觀因素，又能更加科學地體現飲片質量。

為了更科學評價黃芪藥材等級劃分，本實驗在百分質量常數法基礎上，利用PCA分析和OPLS-DA分析以上述5個指標為原變量，28批黃芪藥材較好地分為3個等級。同時運用OPLS-DA分析表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、平均直徑和平均質量可作為黃芩樣品等級劃分的標記。因此，通過外觀特征與有效成分相結合的黃芪等級評價方法，能夠有效地杜絕不法商販把黃芪萃取之后，再烘烤曬干后售賣，保證市場黃芪優質優價，進一步說明質量常數法研究黃芪藥材或飲片等級劃分的科學性與客觀性，保證等級劃分的過程全程量化，使等級劃分更易操作與應用，實現中藥等級劃分的科學傳承。

綜上所述，黃芪藥材的中藥質量常數分級結果與傳統分級方式雖然存在一些差異，但該分級標準即涵蓋了傳統中藥材或飲片評價因素外在形態，又結合了現代評價因素質控指標，可以更加全面、科學地體現藥材質量。黃芪藥材或飲片進行中藥質量常數等級劃分，對于有效控制該藥材質量具有重要的實用價值，為黃芪市場提供更科學的評價手段。