不同生態環境對冷蒿總黃酮積累的影響

薛 焱， 王同智， 劉欣媛， 高洪波， 薛永志

(1.內蒙古醫科大學藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110；2.內蒙古煤炭建設生態環境研究院，內蒙古 呼和浩特 010021；3.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院，內蒙古 包頭 014040)

蒙藥材阿給為菊科蒿屬植物冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.，別名小白蒿、菟毛蒿，是蒙醫常用藥，全草入蒙藥或中藥，中國冷蒿集中分布于內蒙古地區[1-2]。近年來，隨著中藥材標準化工作深入，為提高藥材質量和臨床效果，藥材道地性研究越來越被關注[3-4]，但對蒙藥材的道地性研究甚少。蒙藥冷蒿在蒙古族民間有治療出血疾病的史料記載[5]，牧民取其嫩枝，熱水燙后，和玉米面，蒸煮后食用，是一種含有粗蛋白及無氮浸出物的食物[6]。目前，阿給藥材來源為野生冷蒿，隨著土地日益荒漠化及藥材大量開采，冷蒿草原瀕于退化。對冷蒿的藥學研究主要集中于植物藥材質量標準[7]、生藥學特征[1]、炮制[8]、化學成分[9-10]及含量測定[11]等方面的研究，而對其有效成分的積累規律研究較少[12]，尤其生態環境對冷蒿有效藥用成分積累的影響未見報道。為科學地開發利用冷蒿，本文采集不同生態環境的冷蒿作為實驗材料，分析其總黃酮積累與土壤、地理因子的關系，為地道性冷蒿的采集，提供了科學的依據，為冷蒿種質資源篩選及質量評價提供一定的理論參考。

1 材料

1.1 藥材和土壤 冷蒿ArtemisiafrigidaWilld.于2017年7月從內蒙古5個地區采集，選擇株高相同的地上部分及根際土壤，共100批，經內蒙古醫科大學藥用植物學教研室鑒定確認為正品，具體信息見表1。

表1 冷蒿采集地及所屬生態環境

1.2 儀器與試劑 UV-3010紫外分光光度計(日本日立公司)；BS110S型電子分析天平(德國Startorius公司)；HH-601數顯恒溫水浴鍋(金壇市亮丹實驗儀器廠)。所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 土壤采集及理化性質測定 有機質含量測定采用重鉻酸鉀法，土壤pH測定采用電位法，水解性氮采用堿解擴散法測定，速效磷(P)測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，速效鉀(K)測定采用NH4OAc浸提-火焰光度法。

2.2 冷蒿總黃酮含量測定 索氏提取法提取冷蒿總黃酮，硝酸鋁-亞硝酸鈉分光光度法測定含量，其對照品溶液制備、標準曲線繪制、樣品溶液制備，以及精密度、重復性、穩定性、加樣回收率試驗參照文獻[12]報道。

2.3 統計學分析 通過SPSS 25.0軟件進行處理，對地理、土壤因子與冷蒿總黃酮含量進行簡單相關分析，確定簡單相關因子，再對其進行偏相關分析，排除各因子之間的相互干擾，確定影響冷蒿黃酮含量主要因子，然后對主要因子進行通徑分析和回歸分析，計算影響黃酮含量的主要因子系數及影響程度。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 土壤理化性質 表2顯示，5個地區之間土壤理化性質均存在顯著差異(P<0.05)，其中除pH外，呼倫貝爾市額爾古納產藥材各項指標均高于其他地區，土壤營養豐富；錫林郭勒盟正藍旗產藥材各項指標均低于其他地區，土壤相對貧瘠。

表2 各地區土壤理化性質

3.2 總黃酮含量 按“2.2”項下方法測定，發現吸光度在503 nm波長處敏感，回歸方程在0～96.8 μg/mL范圍內呈良好的線性關系(r=0.999 4)，精密度、重復性、穩定性、加樣回收率試驗均符合相關要求。表3、圖1顯示，不同地區藥材總黃酮含量存在顯著差異(P<0.05)，以烏蘭察布市四子王旗(荒漠草原)和錫林郭勒盟正藍旗(沙地)較高，錫林郭勒盟錫林浩特市(典型草原)次之，呼倫貝爾市海拉爾區(草甸草原)、呼倫貝爾市額爾古納(森林草原)較低。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

表3 不同地區冷蒿總黃酮含量比較

3.3 地理、土壤因子與總黃酮含量的簡單相關分析 表4顯示，總黃酮含量與年均氣溫、海拔呈極顯著正相關關系(P<0.01)，與經度、緯度、有機質和速效K呈顯著負相關關系(P<0.05)，而與水解性N和速效P無相關性(P>0.05)；年均氣溫與海拔呈顯著正相關(P<0.05)，與經度、緯度、有機質和速效K呈顯著負相關(P<0.05)；海拔與經度、緯度呈負相關(P<0.05)；有機質與水解性N呈極顯著正相關(P<0.01)，與速效P呈顯著正相關(P<0.05)；速效P和速效K呈顯著正相關(P<0.05)。但上述相關關系不能真正反映生態環境因子對冷蒿總黃酮含量的影響及各因子之間的相互作用，為排除各因子相互干擾，須進行偏相關分析。

表4 地理、土壤因子與總黃酮含量的簡單相關分析結果

3.4 地理、土壤因子與總黃酮含量的偏相關分析 在“3.3”項下結果基礎上，剔除相關性較差的土壤pH、水解性N、速效P，通過SPSS 25.0軟件中的Partial分析程序對其他因子與總黃酮含量進行偏相關分析。

一階偏相關分析結果表明，無論控制哪幾個因子，相關系數r均大于0.95，年均氣溫與總黃酮含量之間的偏相關系數達到極顯著水平(P<0.01)，呈正相關性；緯度、速效K與總黃酮含量之間的偏相關性達到顯著水平(P<0.05)，呈負相關性；海拔、經度、有機質對總黃酮積累無明顯影響(P>0.05)。

3.5 地理、土壤因子與總黃酮含量的多元回歸分析及通徑分析 將年均氣溫、緯度、速效K作為自變量，分別用X1、X2、X3表示；總黃酮含量作為因變量，用Y表示，進行多元回歸分析，得方程為Y=6.067+0.625X1-0.461X2-0.324X3，P=0.000 31，可知年均氣溫與總黃酮含量存在正相關關系，前者每增加1個單位，后者平均增加0.625；緯度與總黃酮含量存在負相關關系，前者每增加1個單位，后者平均降低0.461；速效K與總黃酮含量存在負相關關系，前者每增加1個單位，后者平均降低0.324。

由通徑分析可知，年均氣溫、緯度、速效K對總黃酮含量直接影響作用的通徑系數分別為r1y=0.734，r2y=-0.242，r3y=-0.255。顯著性檢驗結果表明，上述3個因素通徑系數的顯著性均小于0.05，即對總黃酮含量均有顯著影響。圖2顯示，年均氣溫對總黃酮積累的影響是正向的；緯度、速效K對總黃酮積累的影響是負向的；緯度對年均氣溫、速效K也存在負向影響。這符合內蒙古緯度越高，年均氣溫越低的基本事實，并且也可解釋為緯度通過影響年均氣溫來影響總黃酮含量，緯度與速效K分布呈負相關現象，即內蒙古高緯度高地區速效K含量偏低。

圖2 年均氣溫(X1)、緯度(X2)、速效K(X3)對總黃酮含量(Y)的通徑分析

4 討論

4.1 冷蒿總黃酮積累與土壤營養 冷蒿總黃酮含量并未隨土壤肥力的增高而增加(圖1、表4)，土壤營養豐富的額爾古納地區冷蒿總黃酮含量并不是最高的，反而內蒙古西部的四子王旗含量卻是最高的，這說明土壤貧瘠的內蒙古西部草原可能是藥用冷蒿的最佳產地。2004年，Yan等[13]研究表明藥用品質較高的野生紅景天分布于土壤速效P較為缺乏的地區，這與本研究有相同之處。但與盧麗蘭[14]研究認為土壤營養越好對藥材廣藿香藥用成分積累越有利正好相反，分析其原因可能是因為盧麗蘭的研究是基于室內控制實驗，設置不同水肥條件情況下，施肥對藥用成分的影響，而本研究是基于自然環境下，天然冷蒿的藥用成分與土壤營養的關系。由此可見，水、肥、溫度均有利的室內控制實驗與自然條件下藥用植物的有效成分的積累機制是有區別的，也有可能是廣藿香與冷蒿的物種差異造成的，究竟是何原因造成高總黃酮含量的冷蒿分布于相對營養缺乏的四子王旗草原，還需要下一步采取異地移植栽培實驗的方法進一步研究。

土壤中速效K對冷蒿總黃酮含量積累有負向作用(圖2)，岳聰慧等[15]研究也表明不同栽培區土壤中磷、鉀以及有機質不同，附子品種間雙酯型生物堿以及總堿含量差異明顯。內蒙古地區鉀元素分布是由西到東鉀元素含量逐漸遞減，冷蒿總黃酮含量逆鉀元素分布梯度分布[16]，實驗分析結論與自然背景數據是吻合的，間接印證了冷蒿總黃酮積累對鉀元素是敏感的，需要在以后的研究中進行精準室內試驗加以進一步驗證。

4.2 高品質冷蒿藥材的最佳分布地 通徑分析圖2可知，年均溫度對冷蒿總黃酮的積累貢獻最大，四子王旗恰恰是緯度最低、年均溫度最高的地區，冷蒿能夠適應該地區貧瘠土壤，并在溫度較高的溫帶四子王旗草原完成藥用成分的積累，其合成和積累不僅與植物的基因型有關，與生態環境和土壤也有著密不可分的聯系，生態環境條件變化將引起次生代謝產物含量的變化[16-20]。不同生長環境經緯度、光照的強度、溫度、空氣濕度等生態因子不同對藥用成分含量的累積影響較大[21]。已有的研究顯示黃花蒿[21]、黃芩[22]和紫蘇籽[23]中多數次生代謝產物與緯度成負相關，而與溫度成正相關等現象，本研究也顯示冷蒿總黃酮含量與緯度成負相關，而與年均氣溫成正相關，這些研究都表明藥用植物有效成分對于能量的需求是趨同性，陽光充足、溫度較高的低緯度地區對有效成分積累有積極作用。高緯度環境不利于冷蒿總黃酮的積累，緯度越高，太陽高度角越低，太陽的輻射能量越低，冷蒿種群接受的光、熱越少[24]，冷蒿次生代謝物的總黃酮合成越少，年均氣溫對冷蒿總黃酮含量影響也有類似之處。綜上所述，冷蒿的適宜生態環境為年均氣溫高、緯度低和速效K含量低的荒漠草原(烏蘭察布市四子王旗)。