葛根湯通過下調THRB表達逆轉COC1/DDP細胞順鉑耐藥

趙麗杰， 楊傳軍， 陳蓓蓓， 馬慶良

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院婦產科，上海 201210)

卵巢癌是婦科常見腫瘤，死亡率為婦科惡性腫瘤第一位[1]。目前，以鉑類為基礎的聯合化療是卵巢癌治療的主要手段，但較多卵巢癌患者會出現順鉑(DDP)耐藥，導致患者5年生存率低、預后不良[2]。因此，尋找新型抗腫瘤藥物以提高治療卵巢癌的療效至關重要。葛根湯出自《傷寒論》，由葛根、麻黃、桂枝、生姜、甘草、芍藥、大棗組成，具有發汗解毒、升津舒筋的功效，可以緩輕化療毒副作用、調節機體免疫。方中葛根有效成分葛根素是一種生物類黃酮化合物，已有研究證實葛根素能夠促進癌細胞凋亡、抑制癌細胞增殖和周期進展、發揮較好的抗腫瘤作用，其在胃癌細胞中改善DDP耐藥的作用已經得到證實[3]。卵巢癌 DDP耐藥的機制十分復雜，隨著分子生物學研究的不斷深入，越來越多的研究者開始從基因水平去探討疾病的發生進展以及潛在的診療措施[4]。激素是機體組織生物功能重要的調節物質，隨著研究的深入，研究者發現激素在腫瘤細胞的分裂、凋亡和遷移中扮演重要角色,在多種惡性腫瘤細胞中激素及激素受體基因往往呈異常表達狀態[5]。甲狀腺激素(TH)及其受體(TR)可以影響MAPK、PI3K等通路起到抑制腫瘤細胞生長和轉移的作用，而甲狀腺激素受體基因(thyroid hormone receptor，THRB)是一種激素受體相關基因，與細胞的生長密切相關，在細胞的增殖、分化、DNA修復和周期轉換中發揮重要的參與作用[6]。近年來研究報道顯示，THRB在卵巢癌耐藥細胞中的呈異常高表達，提示THRB的異常與卵巢癌的耐藥密切相關[7]。目前關于葛根湯在卵巢癌中是否存在類似的生物作用及具體機制仍未明確。本研究以人上皮性卵巢癌耐藥COC1/DDP細胞為模型探討葛根湯對其增殖、凋亡的影響是否調控THRB基因的表達，初步探討THRB在其抗卵巢癌作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞 卵巢癌細胞株COC1、順鉑耐藥卵巢癌細胞株COC1/DDP，購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 試劑、儀器與藥物 葛根湯組方藥材葛根21 g、桂枝9 g、芍藥9 g、生姜9 g、甘草6 g、大棗12枚、麻黃9 g，由上海曙光醫院藥劑科制劑中心(中藥制劑研究室)一次性加工完成，制成生藥量0.66 g/mL的濃縮液，在4 ℃下保存備用。注射用順鉑(CisPlatinDDP，山東齊魯制藥有限公司)；DMEM培養基、胎牛血清(上海明豐生物科技有限公司)；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、胰蛋白酶消化液、細胞裂解液(美國R&D Systems公司)；THRB質粒中量抽提試劑盒及P-gp、MRD-1抗體(福州邁新生物技術開發有限公司)；一抗(抗THRB 單克隆抗體)、anti-β-actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；PVDF膜(美國Corning公司)；四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazo-lium, MTT)試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)；Trizol試劑盒、TaqMan miRNA反轉錄試劑盒、SYBR Prellix Ex TaqTM實時PCR試劑盒(日本Takara公司)；ECL試劑(上海碧云天生物技術有限公司)。Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)。引物合成由北京華大基因研究中心有限公司完成。

1.3 含藥血清制備 參照《藥理實驗方法學》[8]中的動物與人體的每千克體質量劑量折算系數表，按成人推薦日用量的0.5、1、2倍設立葛根湯低、中、高劑量組，經煎煮、過濾、水浴蒸發至生藥量分別為0.657、1.313、2.626 g/mL，冷卻后在4 ℃下保存。SD級雌性大鼠40只，購自中國科學院上海實驗動物中心，飼養于清潔級動物房，體質量(200±10)g，隨機分為對照組及葛根湯低、中、高劑量組，分別灌胃給予生理鹽水及3.29、6.57、13.13 g/kg葛根湯，每天1次，連續3 d，最后1次給藥1 h后，采集腹主動脈血，2 000 r/min離心5 min，取血清，56 ℃水浴滅活30 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取上清液，-80 ℃保存待用。

1.4 細胞培養 COC1/DDP、COC1細胞株常規培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中, 在37 ℃、5%CO2條件下培養，取對數生長期的細胞，每2 d換液1次，0.25%胰酶消化，每4～6 d傳代1次。實驗時取對數生長中期細胞，制成單細胞懸液，計數待用。

1.5 生長曲線繪制 10%胎牛血清DMEM培養基200 μL培養COC1、COC1/DDP細胞，貼壁后于12、24、48、72 h采用MTT法檢測細胞生長狀況，繪制生長曲線。

1.6 含藥血清篩選 取對數生長期COC1、COC1/DDP細胞，調整細胞密度至1 ×105/mL，隨機分為空白對照組及含藥血清低、中、高劑量組，空白對照組采用200 μL含10%大鼠血清的DMEM培養，含藥血清低、中、高劑量組分別加含200 μL 10%低、中、高劑量大鼠含藥血清的DMEM培養液，每組設5個復孔, 空白孔中加入蒸餾水調零。培養12、24、48、72 h后，加入20 μL MTT(5 g/L)，在37 ℃下培養4 h后吸棄上清液，每孔加入150 μL DMSO振蕩10 min，在570 nm波長處用酶標儀檢測吸光度，重復3次，取平均值。細胞生長抑制率=[1-(給藥組吸光度/空白組吸光度)]×100%。

1.7 含藥血清對COC1、COC1/DDP細胞耐藥逆轉作用研究 取對數生長期的COC1、COC1/DDP細胞，調整密度至1×105/mL，隨機分為順鉑+葛根湯最佳含藥血清組、順鉑+對照血清組，每組順鉑濃度設為6、12、25、50、100、200、400 μmol/L。待細胞貼壁后，順鉑+最佳含藥血清組加入含10 μL不同濃度的順鉑、含10%葛根湯最佳含藥血清的DMEM培養液；順鉑+對照血清組加入含10 μL順鉑、200 μL含10%大鼠對照血清的DMEM培養液，每組設5個復孔，使每組加入血清總量相同，同時設立空白孔(只含培養基)進行校正，在37 ℃、5% CO2條件下培養48 h，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續培養4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO，搖床振蕩10 min，在570 nm波長處檢測各孔吸光度，重復3次，取平均值，計算細胞生長抑制率。采用GraphPad Prism 5.0軟件計算順鉑對COC1/DDP、COC1細胞的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)，耐藥指數(resistance index,RI)=耐藥細胞株IC50/敏感細胞株IC50。

1.8 RT-qPCR檢測THRBmRNA表達 對照組只加含200 μL含10%大鼠對照血清的DMEM培養液COC1細胞，DDP組加入含10 μL順鉑、200 μL含10%大鼠對照血清的DMEM培養液處理的COC1/DDP細胞，給藥組加入“1.3”項下低、中、高劑量葛根湯含藥血清的DMEM培養液處理的COC1/DDP細胞。RT-qPCR檢測COC1細胞的THRBmRNA的表達，Trizol法提取總RNA，逆轉錄試劑盒對RNA樣品進行逆轉錄以合成cDNA，逆轉錄反應條件為42 ℃ 30 min，逆轉錄酶失活條件為85 ℃ 15 s。SYBR Green PCR Master Mix和PCR檢測系統進行RT-qPCR實驗，條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，40個循環；最終延伸75 ℃ 10 min，保持在4 ℃。比較循環閾值ΔΔCT用于分析RNA的表達，GAPDH、U6表達用于標準化。

1.9 Western blot檢測MRD-1、P-gp蛋白 將COC1/DDP、COC1細胞清洗后裂解、離心，收集總蛋白，檢測蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜轉膜，在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h，加入相應一抗(稀釋1∶1 000)，在室溫下振蕩2 h，4 ℃下孵育過夜，加入二抗(稀釋1∶5 000)孵育3 h。通過Quantity One軟件分析條帶灰度值，計算目標蛋白表達量。

2 結果

2.1 COC1、COC1/DDP細胞生長曲線 COC1、COC1/DDP細胞在12、24、48 h吸光度不斷增加，48 h達到高峰，但在72 h時吸光度明顯下降，細胞死亡增多，見圖1。

圖1 COC1、COC1/DDP細胞生長曲線

2.2 劑量、作用時間篩選 不同劑量葛根湯含藥血清對COC1、COC1/DDP細胞生長抑制率隨著時間延長不斷增加，48 h達到高峰，呈時間-劑量依賴效應，但在72 h有所下降，可能與其增殖能力下降、死亡細胞較多有關；低劑量含藥血清對COC1、COC1/DDP細胞的抑制率均<10%，與中、高劑量含藥血清作用24、48 h抑制率比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。前期報道表明，抑制率小于10%時對敏感株和耐藥株細胞均無明顯細胞毒作用[9]，故本實驗選擇含藥血清10%作為劑量，48 h作為作用時間。

表1 葛根湯對COC1、COC1/DDP細胞生長抑制率的影響

2.3 含藥血清對COC1/DDP細胞耐藥逆轉的影響 順鉑對COC1/DDP細胞的IC50為(209.46±1.11)μmol/L，對COC1細胞為(27.51±0.12)μmol/L，COC1/DDP細胞對順鉑的耐藥指數為7.61；葛根湯含藥血清聯合順鉑對COC1/DDP細胞的IC50為(84.41±0.18)μmol/L,對COC1細胞為(22.84±0.42)μmol/L，COC1/DDP細胞對葛根湯含藥血清聯合順鉑的耐藥指數為3.69，提示聯合葛根湯和順鉑治療卵巢癌具有明顯協同作用，能抑制COC1/DDP細胞生長，提高COC1/DDP細胞對順鉑的的敏感性，具有逆轉COC1/DDP細胞腫瘤耐藥的作用。

2.4 葛根湯對COC1/DDP細胞中THRB mRNA及蛋白表達的影響 在卵巢癌COC1細胞中，THRB為低水平轉錄表達；在耐藥COC1/DDP細胞中，THRB均為高水平轉錄表達。葛根湯干預后，COC1/DDP細胞內高水平轉錄的THRBmRNA轉錄下調，THRB蛋白表達降低，各劑量組的THRB mRNA及蛋白表達與DDP組比較均降低(P<0.05，P<0.01)，見表2、圖2。

表2 各組THRB mRNA相對表達比較

圖2 各組THRB蛋白表達

2.5 葛根湯對COC1/DDP細胞中MRD-1、P-gp表達的影響 葛根湯作用于卵巢癌COC1/DDP細胞48 h后MRD-1、P-gp耐藥相關蛋白表達減少，并呈一定的劑量依賴性(P<0.05)，見圖3～4。

注：與DDP組比較，*P<0.05。

注：與DDP組比較，*P<0.05。

3 討論

鉑類藥物是惡性腫瘤臨床應用廣泛的一線化療方案，但鉑類藥物的耐藥性是造成患者化療失敗、腫瘤復發的重要原因[10]。自20世紀90年代研究者便發現鈣通道拮抗劑能夠逆轉腫瘤細胞的耐藥性，但是這些逆轉劑大多靶點單一、抗腫瘤耐藥性效果不理想，且中毒劑量與逆轉耐藥性劑量太過接近[11]。

葛根湯出自《傷寒論》，由葛根、麻黃、桂枝、生姜、甘草、芍藥、大棗組成[12-13]。葛根活性成分葛根素是生物類黃酮化合物，現代藥理研究證實其葛根素具有減少腫瘤細胞的MDR、P-gp、MRP的表達的多重作用進而逆轉裸鼠原位移植瘤的多藥耐藥性[14]。葛根素對癌細胞具有高度選擇性，能夠高選擇性地誘導癌細胞凋亡，而不損傷正常細胞，據Gan[15]和劉銀莉等[16]介紹葛根素能通過PI3K/Akt/NF-κB信號通路途徑抑制CyclinD1表達，促進細胞凋亡發揮抗腫瘤作用，但葛根湯在卵巢癌治療中能否具有同樣的逆轉腫瘤細胞的耐藥性功效及其具體機制仍無確切定論，因此本文以COC1/DDP細胞為體外研究模型探討葛根湯對于卵巢腫瘤細胞耐藥的功效及其可能的作用機制。

本文通過MTT法篩選得出10%低劑量含藥血清作用48 h為含藥血清考察劑量及考察作用時間。為排除葛根湯的細胞毒作用的影響，在前述的實驗基礎上本研究選用在低劑量的葛根湯含藥血清處理下培養48 h，DDP對于COC1/DDP細胞IC50降低，且與單純的DDP作用組比較其耐藥指數由7.61下降至3.69，提示葛根湯可以逆轉COC1/DDP細胞對鉑類藥物的的耐藥性，增加腫瘤細胞對含鉑類藥物化療敏感性。

近年來，越來越多的研究證實卵巢癌屬于激素依賴性腫瘤，機體內分泌紊亂，激素失調會導致對正常細胞的調節作用失控，進而導致細胞的的自主凋亡及增殖減少，使得卵巢癌細胞產生耐藥[17]。甲狀腺激素水平異常增高能夠促進乳腺癌細胞生長，而甲狀腺激素水平降低時雖然會使得乳腺癌細胞生長減緩，但是會增加乳腺癌細胞上皮-間質轉化能力，甲狀腺激素及其受體可能通過細胞核、細胞膜、腫瘤微環境及細胞凋亡等各個層面對乳腺癌的發生發展起促進或抑制作用[18]。研究證明卵巢癌上皮組織中的甲狀腺激素受體蛋白(TRβ)的轉錄和表達均表現出明顯異常，TRβ可以通過與甲狀腺激素反應元件特異性結合，調節相關靶基因的轉錄進而調控相關細胞生成分化[19]。另外，細胞內甲狀腺激素受體缺失促進乳腺癌發生進展。THRB是甲狀腺激素受體基因，國外學者通過敲除小鼠THRB基因證實THRB能夠與P85(PI3K小亞基)結合，促進PI3K活化，激活Akt/mTOR磷酸化通路[20]。米雪等[21]指出PI3K/Akt/mTOR信號通路在卵巢癌耐藥中扮演重要角色。多藥耐藥相關蛋白(MRP)是一種跨膜糖蛋白，在真核及原核生物的跨膜分子轉運中扮演重要角色。P-gp是轉運蛋白的超家族，研究已經證實MRP1、P-gp異常高表達是造成腫瘤化療耐藥的重要原因之一[22]。

李君等[7]采用體外研究發現甲狀腺激素能促進人卵巢癌細胞和人卵巢癌耐順鉑細胞的增殖，THRB在卵巢癌耐藥細胞中的表達遠高于一般卵巢癌細胞,THRB對卵巢癌耐藥起著非常重要的作用，可能是耐藥相關基因。本實驗結果顯示，COC1/DDP細胞中THRBmRNA的表達高于COC1細胞，提示THRB可能參與卵巢癌的化療耐藥，其表達與患者的預后密切相關。葛根湯含藥血清處理后，COC1/DDP細胞中THRBmRNA表達較單純DDP組下調，提示葛根湯可調節THRB基因的轉錄表達。不同劑量的葛根湯分別作用于卵巢癌COC1/DDP細胞48 h后MRD-1、P-gp耐藥相關蛋白表達減少，且呈一定的劑量依賴性，葛根湯劑量越高腫瘤細胞的耐藥相關蛋白表達降低越明顯提示THRB的抑制劑在抑制腫瘤細胞的DNA修復中效果較好，能夠逆轉卵巢癌COC1/DDP細胞的耐藥性，增加其對DDP的敏感性，從而誘導腫瘤細胞凋亡及抑制其增殖而延緩腫瘤細胞的生長，可作為新型的抗腫瘤藥物。提示葛根湯能夠通過下調THRB基因表達，逆轉卵巢癌腫瘤細胞順鉑耐藥。方中葛根升津液，濡筋脈為君，能夠增加機體免疫；陳小紅等[23]通過實驗研究證實葛根素能夠通過抑制MDR1和MRP基因轉錄和P-gp蛋白介導的藥物外轉運功能進而逆轉K562/ADR細胞腫瘤多藥耐藥性。桂枝能上調PTENmRNA和下調MTDHmRNA表達，促進SKOV3/DDP卵巢癌耐藥細胞凋亡、抑制癌細胞的增殖，逆轉細胞耐藥[24]。諸藥合用，存在協同作用。

綜上所述，葛根湯能夠有效降低人卵巢癌順鉑多藥耐藥COC1/DDP細胞耐藥性，提高其對化療藥物的敏感性，其機制可能與降低THRB基因表達有關。