正交實驗優化油茶粕中糖萜素提取工藝

袁成華，楊瓊玲，鄧愛華 ，李菊元，何婉琳

（1.湖南省康多利油脂有限公司，湖南 常德 415700；2.湖南文理學院 生命與環境科學學院，湖南 常德 415000）

我國油茶資源豐富，油茶籽炸油后剩余的油茶粕中富含有大量的糖萜素。糖萜素是一類由茶皂素( ≥30% ) 、多糖( ≥30% ) 及蛋白等組成的天然活性物質，主要用于飼料添加劑，替代抗生素在飼料中的應用，其具有化學成分穩定、無抗性干擾、無藥殘、無抗藥性及無任何配伍禁忌，可配制成預混合飼料[1-2]。在動物飼料中添加糖萜素后，動物機體的免疫力得到大大增強，抗生素的用量大大減少[3]。目前，糖萜素的主要提取方法有溶劑直接提取法、轉化合成法和生物酶法等。水提法較為經濟，但水溶性雜質較多，糖萜素收率較低；甲醇提取法比水提法收率提高了80%，但甲醇易揮發且有一定的毒性，對于操作工人身體有一定的損害[4-5]；轉化合成法需先將茶皂素和茶多糖分開提取，再按照比例進行合成轉化，制備的糖萜素純度較高，但工藝復雜，收率偏低[6]；微生物發酵法發酵時間長，發酵設備投資大[7-8]。本實驗擬先通過超臨界二氧化碳代替石油醚除脂，其脫脂效率高，能進一步提高糖萜素的溶出率，所用乙醇溶劑安全且可以回收循環利用。通過單因素實驗和正交實驗設計優化糖萜素提取工藝參數，并對所制備的糖萜素中總皂苷、總糖含量、總蛋白等關鍵指標進行檢測分析，以期為油茶廢棄物中糖萜素的綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶粕：湖南省康多利油脂有限公司；3,5-二硝基水楊酸（分析純）、茶皂素（分析純）、牛血清蛋白（分析純）、考馬斯亮藍（分析純）、高氯酸（分析純）、香草醛（分析純）、乙醇（分析純）：國藥化學試劑有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JB/T5374型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-1600型分光光度計：翱藝儀器有限公司；ZWL-LS1-10型超純水機：湖南中沃水務環?？萍加邢薰荆籇ZF型真空干燥箱：邦西儀器科技有限公司；HH-6JS型磁力攪拌水浴鍋：常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 糖萜素制備工藝

油茶粕→粉碎→超臨界流體脫脂→乙醇浸提→過濾→真空濃縮→濃縮物正丁醇萃取→萃取相真空濃縮→濃縮物真空干燥→糖萜素成品

1.3.2 糖萜素含量及質量指標測定方法

糖萜素含量及質量測定方法參考國家標準[9-10]的方法。茶多糖測定：采用3,5-二硝基水楊酸法；總皂苷測定：高氯酸-香草醛法；蛋白質測定：考馬斯亮藍法；糖萜素提取率按式（1）計算。

1.3.3 單因素實驗設計

準確稱取5份經脫脂的油茶粕20 g，按照液固比20:1（mL/g）加入75%的乙醇水溶液，在80 ℃下浸提3 h，浸提1次，浸提液按照1.3.1所述步驟提取糖萜素，根據標準曲線方程計算糖萜素的提取率。單因素實驗分別考察乙醇濃度（55%、65%、75%、85%、95%），浸 提 溫 度（50、60、70、80、90 ℃），液固比（10:1、15:1、20:1、25:1、30:1（mL/g）），浸提時間（1、2、3、4、5 h）浸提次數（1、2、3、4、5）等對糖萜素提取率的影響規律；當考察某一因素時，其他因素按上述條件不變。

1.3.4 正交實驗設計

根據單因素實驗結果，選定適宜的甲醇濃度、浸提液固比、浸提時間、浸提溫度和浸提次數等5個因素的水平，運用 L16( 45) 正交表確定最佳工藝條件，實驗因素水平及編碼見表 1。

表1 正交實驗因素水平

2 結果與分析

2.1 標準曲線方程

2.1.1 多糖標準曲線方程

如圖1所示，以葡糖糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制多糖標準曲線，通過擬合得到多糖標準曲線方程為Y= 1.063 8X+ 0.027 7，R2= 0.991 8，說明所選取的線性范圍好。

2.1.2 茶皂素標準曲線方程

如圖2所示，以茶皂素濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制茶皂素標準曲線，通過擬合得到多糖標準曲線方程為Y= 0.539 6X+ 0.099 9，R2= 0.999 1，說明所選取的線性范圍好。

2.1.3 蛋白質標準曲線

如圖3所示，以牛血清蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制牛血清蛋白標準曲線，通過擬合得到多糖標準曲線方程為Y= 0.049 5X+ 0.029 4，R2= 0.997 4，說明所選取的線性范圍好。

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對提取率的影響

如圖4所示，隨著乙醇濃度的增加，糖萜素收率逐漸增大，當乙醇濃度達到75%時，糖萜素收率達到最大26.5%；當進一步提高溶劑中乙醇濃度，糖萜素的收率呈現下降趨勢。可能是提高乙醇濃度，溶劑的極性降低，物料中茶皂素或茶多糖等溶出度降低，導致糖萜素的整體比例下降，選擇合適的乙醇濃度在65%～85%。

2.2.2 溫度對提取率的影響

如圖5所示，當溫度較低時，物料中糖萜素在浸提液中的溶解性較差，分子運動較慢，不利于物質的傳質。前期隨著溫度的上升，溶解度不斷增加，糖萜素提取率增加較快，在75 ℃左右提取率達到最大26.7%。此時物料中的糖萜素傳質速率已經達到最大，當溫度進一步升高時，影響不明顯；80 ℃以上，乙醇的揮發性增加，降低了提取液的量，高溫也會加速物料中的蛋白質和果膠等雜質變性沉淀。綜合能耗成本和設備成本，選擇提取溫度在65～85 ℃較為適宜。

2.2.3 液固比對提取率的影響

如圖6所示，隨著乙醇體積的增加，糖萜素提取率增加；當比例達到20:1（mL/g）時，糖萜素提取率達到26.3%，后續增加溶劑的比例，對提取率影響不大，說明糖萜素基本提取出來。溶劑用量太大，一方面增加溶劑的消耗量，另一方面增加后續濃縮成本；同時，提取的糖萜素中蛋白類等其他雜質含量偏高，增加純化成本和降低產品品質。合適的提取液固比控制在15:1～25:1（mL/g）較為合適。

2.2.4 時間對提取率的影響

如圖7所示，隨提取時間的增加，糖萜素收率不斷增加，當達到3.0 h后，繼續增加提取時間，糖萜素收率增長幅度較小，表明物料中的糖萜素已基本溶出，糖萜素的傳質過程基本達到平衡。從生產周期和設備能耗綜合考慮，適宜的提取時間為2.5～3.5 h。

2.2.5 提取次數對提取率的影響

如圖8所示，糖萜素提取率與提取次數呈正相關，前2次提取率增加幅度較大，后續增長幅度較小。提取次數越多，溶液中水溶性雜質的比例會明顯增多，導致后續糖萜素的純度下降；同時，提取次數的增加也會導致濃縮成本和分離成本增加，選擇提取次數在2～3次較為適宜。

2.3 正交實驗

通過擬水平補充法設計L16( 45) 正交實驗如表2所示。由表2可知，各因素對糖萜素提取量的的影響大小依次為：E（提取次數）＞ A（乙醇濃度）＞ D（時間）＞ C（液固比）＞ B（溫度），在選取的因素考察范圍內，提取次數的影響最顯著，其次是乙醇的濃度，提取的液固比和溫度影響比較小。根據優化分析，較合適的提取工藝參數為E2A3D2C1B2，該工藝下提取工藝所需溶劑消耗量小和能耗低。

正交實驗優化得到油茶粕中糖萜素提取的最佳工藝參數為E2A3D2C1B2，即在乙醇濃度80%、溫度75 ℃、液固比15:1（mL/g）下提取3 h，提取2次，最佳組合不在本正交實驗設計中，按此條件組合提取糖萜素的收率為33.47%，與正交實驗的最高得率33.21%接近。

2.4 糖萜素質量分析

根據GB/T 25247—2010《飼料添加劑 糖萜素》的關鍵質量指標為總皂苷≥30%，配糖體≥30%，粗蛋白量≥7%，干燥失重≤7.0%。本實驗提取的糖萜素呈淺棕黃色，根據標準曲線方程計算糖萜素中總皂苷含量為32.2%，總糖含量為34.7%，干燥失重率為5.7%，蛋白含量為12.3%，均滿足國標中糖萜素的質量指標。

3 結 論

本實驗通過單因素實驗探討各因素對茶籽粕中糖萜素提取率的影響規律，并通過正交實驗設計優化得到最佳提取工藝參數乙醇濃度80%、溫度75 ℃、液固比15:1（mL/g）、時間3 h、提取2次，糖萜素的收率為33.47%；經檢測分析所制備的糖萜素各項關鍵技術指標符合國家標準要求。本實驗可為我國茶油產業副產物的綜合開發利用提供參考。