指紋圖譜技術在蛋白基食品品質鑒定中的應用

何曉峰，溫小波，滕 博*

（汕頭大學理學院，廣東 汕頭 515063）

前 言

隨著生活水平的提升，人們對食品質量、食品安全的要求隨之提高.蛋白質是人體必需的六大營養元素之一，從膳食中補充蛋白質是人體攝入蛋白質的主要來源[1].為確保蛋白基食品的安全和質量，我們需要建立完善的食品質量監管體系.目前已有相當多的食品質量分析和評價的方法，但是由于食品成分的復雜多變性，難以形成一個普遍有效的質量監控體系.指紋圖譜技術則能夠對食品組分進行全面分析[2]，可以特異性的表征食品內各營養成分的相互關系，在食品品質分析、摻假摻雜檢測、產地鑒別等方面已得到廣泛應用.

指紋圖譜技術針對食品組分的多樣性和復雜性特點，借助光譜、色譜等現代分析手段，獲取能夠體現食品共有特性的圖譜[3-5].指紋圖譜具有整體性、專屬性、穩定性等特點，是一種有效的食品分析工具.蛋白質是蛋白基食品的主要營養成分，具有數量大、種類多、易變化的特點.蛋白質指紋圖譜能很好地反映該蛋白基食品的特征，在蛋白基食品的生產質量管理、品質鑒定等方面有很大的應用價值[6].本文對近年來指紋圖譜技術在蛋白基食品品質分析方面的應用進行了綜述，以期為蛋白基食品質量管理體系的建立提供參考.

1 光譜法

光譜法是基于物質與輻射能作用時，測量由物質內部發生量子化的能級之間的躍遷而產生的發射、吸收或散射輻射的波長和強度的方法.由于其簡便快速，靈敏度高的特性，在蛋白基食品分析方面應用廣泛.常用的有傅里葉變換紅外光譜、熒光光譜、拉曼光譜、圓二色光譜、X射線衍射等，另外還有核磁共振波譜、質譜等方法.

1.1 傅里葉變換紅外光譜法（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）

傅里葉變換紅外光譜是在紅外分光光度計的基礎上發展起來的第三代紅外光譜技術，是計算機技術與紅外光譜技術相結合的應用，其將檢測到的干涉信號，經過計算機的傅里葉變換，從而得到分辨率更高的圖譜.在紅外光的照射下，樣品中的分子會吸收特定波長的電磁波，進而產生振動和轉動躍遷，引起偶極矩發生不同的變化，通過檢測這些變化，就能得到該樣品的特征紅外光譜.FTIR絕大多數有機物的基頻吸收帶一般都出現在中紅外區（4 000～400 cm-1）[7]，這一區域又分為官能團區（3 700～1 700 cm-1）和指紋區（1 700～650 cm-1），官能團區峰少，比較固定，容易解析；指紋區峰復雜，變化大，可用于鑒定蛋白質的官能團以及蛋白質的分子結構研究.蛋白質在指紋區主要有3個特征帶（酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶），分別是由C＝O的伸縮振動、N-H伸縮振動及彎曲振動、C-N伸縮振動產生的吸收帶[8].Ashwini Kher等[9]人使用FTIR研究發現，不同噴霧干燥的乳蛋白濃縮粉的酰胺Ⅰ和Ⅱ帶以及指紋區的紅外光譜經過二階導數和歸一化處理去除物理性差異后，酰胺Ⅰ帶的α-螺旋和β-折疊與酰胺Ⅱ帶的峰形、譜帶位移、吸收強度等變化顯著，該指紋圖譜可以很好地區分經過不同加工處理的乳蛋白粉.

FTIR圖譜不僅可以研究蛋白質官能團的變化，經過去卷積、二階導數、歸一化、高斯擬合等處理之后，還可以得到其二級結構的變化信息.Manpreet等[10]將牛奶蛋白的紅外光譜指紋圖譜進行以上處理后，選取1 700～1 500 cm-1（酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶）區域進行高斯曲線擬合，發現不同處理的牛奶蛋白其酰胺Ⅰ帶的α-螺旋（1 654～1 658 cm-1）、β-折疊（1 623～1 643 cm-1和 1 689～1 698 cm-1）、β-轉角（1 666～1 687 cm-1）、無規則卷曲（1 646～1 650 cm-1）條帶變化明顯，根據高斯曲線積分面積還可以估算出各二級結構的含量百分比，這種指紋識別方法可以明顯地識別出各種不同處理后的牛奶蛋白.目前F TIR大多采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR），該法操作簡便，樣品無需前處理，可以實現對樣品的無損檢測，已廣泛應用于各種固體以及液體樣品的分析.Aloglu等[11]利用ATR-FTIR結合模式識別方法，根據蛋白質紅外光譜特征成功鑒定出牛明膠、豬明膠和魚明膠，表明ATR-FTIR可用于鑒別動物明膠來源.

1.2 熒光光譜法（Fluorescent spectrometry，FS）

熒光是電子吸收光子能量后，產生振動躍遷，從激發態返回基態時，以輻射躍遷方式失去的能量.蛋白質發熒光的原因是其中含有芳香族氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）或者蛋白質活性中心含有金屬原子等內源性熒光基團[12].熒光基團的種類、含量以及蛋白質的結構等都會對蛋白質的熒光強度、熒光波長、熒光壽命等性質產生影響，因此蛋白質熒光光譜具有一定的指紋性，可用于蛋白質含量測定、結構分析、相互作用分析、動力學分析等.例如Kokawa等[13]根據蛋白質受熱結構會發生改變這一特性，建立了豆奶在不同溫度加熱下的熒光指紋圖譜，結合偏最小二乘模型分析，成功預測了不同狀態豆奶制品的加熱溫度，這對于豆奶的生產可以起到品質控制的作用.然而并不是所有的蛋白質都可以產生熒光，對于沒有熒光特性的蛋白質，可以通過熒光染料、熒光探針、熒光標記蛋白質芯片等方法，將熒光物質與被檢測蛋白質結合，使蛋白質熒光信號增強或減弱或猝滅，從而達到目標蛋白檢測的目的.YuKi等[14]采用熒光標記結構肽制備的蛋白質芯片，建立了一種快速檢測病人唾液中的蛋白質從而確定病人是否患有牙周病的方法.實驗表明，通過檢測標記肽的熒光強度變化得到的熒光指紋圖譜，可以鑒定出健康者與患牙周病患者.

熒光光譜法中，根據檢測目標的不同，又分為同步熒光光譜[15]、前表面熒光光譜[16]、三維熒光光譜等，其中三維熒光光譜以熒光強度、激發波長、發射波長作為維度，其立體圖譜能夠反映物質的熒光強度隨著激發波長和發射波長而變化，所得的信息更為豐富，在構建指紋圖譜方面具有廣泛應用.牛乳中含有豐富的發色基團，具有不同的激發和發射波長，而且還有多種類型的蛋白質，可以結合不同的熒光染料；根據這兩個特點，杜麗娟[17]采集了生鮮乳和摻入奶粉的還原乳的三維內源熒光光譜和二維外源熒光圖譜，結合分類模型分析方法發現這兩種圖譜均可以用于判定還原乳的摻假程度，其準確率高達100%.

1.3 拉曼光譜法（Raman spectroscopy，RS）

入射光子和分子發生碰撞時，發生了能量轉移，引起分子振動或轉動，使入射光波長頻率發生改變的非彈性散射稱為拉曼散射，偏移的波數稱為拉曼頻移，其只與分子的振動和轉動能級有關.拉曼光譜圖與紅外光譜圖相似，是紅外光譜的補充，它根據蛋白質分子的振動程度來構建蛋白質指紋圖譜，目前是檢測蛋白質二級結構、分子結構及構象的主流方法之一[18].與紅外相比，它具有不受水分子干擾的優點，更適用于不同狀態樣品的檢測.楊雪倩等[19]利用共聚焦拉曼光譜構建了不同霉變程度玉米的黃曲霉毒素（AFB1）和玉米赤酶烯酮（ZEN）的拉曼圖譜，數據經過GaussLor擬合預處理，找到420～550 cm-1、790～980 cm-1和1 050～1 500 cm-1三個特征波段，歸屬為玉米毒素所在區域，以特征波長建立的BP神經網絡模型可以更好地實現對AFB1和ZEN含量的預測，這為谷物品質的快速檢測提供了參考.Yin等[20]對大豆球蛋白的二級結構進行拉曼光譜分析發現，大豆球蛋白的二級結構主要由21.50%的α-螺旋、41.62%的β-折疊、24.70%的β-轉角和12.18%的無規則卷曲組成.

近年來，一些能提高拉曼光譜分辨率的衍生技術得到了飛速發展，例如紫外線共振拉曼光譜（UVRR）、深紫外線共振拉曼光譜（DUVRR）、表面增強拉曼光譜（SERS）、紅外-拉曼光譜聯用（IR-RS）等.其中SERS具有超高靈敏度特性，該技術能夠極大限度地提供蛋白質樣品固有的指紋信息.Tian等[21]通過分析溶菌酶和細胞色素c兩種蛋白質主鏈的酰胺Ⅲ帶的SERS信號，發現隨著蛋白質濃度的增大，溶菌酶二級結構中的無規則卷曲會轉變為α-螺旋和β-折疊；而細胞色素c的二級結構仍保持恒定的比例.以上研究表明我們可以通過拉曼光譜的方法建立蛋白質二級結構的指紋圖譜，用以分析蛋白基食品在不同情況下的變化，從而進行品質控制.

1.4 圓二色光譜法（Circular dichroism spectroscopy，CD）

當光經過光學活性物質時，介質對左旋、右旋圓偏振光的吸收系數不同，二者的差值即為該物質的圓二色性.具有圓二色性的物質能夠使平面偏振光偏轉為橢圓偏振光，橢圓度與吸收系數差值成正比，圓二色光譜則是記錄平面偏振光的波長與吸收系數差值的圖譜.蛋白質是具有圓二色性的物質，其中的光學活性基團主要有肽鍵、芳香族氨基酸殘基、二硫橋鍵，蛋白質光學活性不僅受基團影響，還受蛋白質折疊的影響[22]，因此可以得到具有特征性的圓二色光譜.蛋白質的圓二色光譜主要在較稀的溶液狀態下測定，對于樣品的純度和制樣要求較高，可以得到蛋白質的結構信息.李萌等[23]使用CD法得到羊乳和牛乳β-酪蛋白的圓二色圖譜，分別在192 nm、185～200 nm、200 nm、206 nm的正峰出現α-螺旋、β-折疊、無規卷曲和β-轉角的特征峰；分析結果表明，羊乳β-酪蛋白的無規卷曲含量比牛乳β-酪蛋白更高，分子結構趨向無序.Vanga等[24]采用CD法探究了脈沖超聲加工對杏仁乳蛋白二級結構的影響，結果表明，隨著超聲時間延長，杏仁乳蛋白中的α-螺旋有向β-折疊轉變的趨勢.楊嬌等[25]建立了兩種不同干燥方式處理下的馬鈴薯蛋白質CD圖譜，比較兩者圖譜發現，高壓電場干燥（HVEF）會使蛋白質α-螺旋減少，其他二級結構增加，但總體變化比例相較于熱風干燥對蛋白質二級結構造成的變化更小，這說明HVEF更適合對馬鈴薯進行加工.雖然圓二色光譜應用廣泛，但也存在一些局限，例如樣品中存在光吸收的雜質和緩沖液時會產生光散射現象，以及氙弧燈在200 nm以下波長區時發出的光源強度會突然下降，這些情況的出現對CD光譜的質量有較大的干擾，為了克服這些不足，逐漸發展起了一種利用同步加速器光束的輻射作為光源來采集樣品CD信息的方法，這種方法稱為同步輻射圓二色光譜（SRCD）[26].SRCD不僅可以研究蛋白質二級結構的細微變化，還可以監測蛋白質動態構象變化.Jochen等[27]使用SRCD研究了不同熱處理下膠原納米纖維的結構變化，隨著加熱溫度的提高，原膠原納米纖維的Ⅱ型聚脯氨酸（PP-Ⅱ）含量從60%～70%下降到30%～40%，并且膠原的三股螺旋結構進一步展開.這些研究證明了CD法是構建蛋白質指紋圖譜的有利工具，在蛋白基食品品質控制方面具有重要作用.

1.5 核磁共振波譜法（Nuclear magnetic resonance spectroscopy，NMR）

核磁共振波譜法是一種波譜技術，它的工作原理是添加一個入射頻率與原子核自旋進動頻率相同的射頻場，原子核吸收射頻場的能量，由低能態躍遷到高能態，從而產生核磁共振的現象.同一種原子核在不同的化學環境中具有不同的核磁共振頻率，因此通過核磁共振，可以知道原子核的化學位移、共振信號強度等特征信息[28]，進而得到被分析物質的化學組成、基團結構，所以NMR是構建指紋圖譜的強有力工具.近年來，核磁共振代謝指紋圖譜在蛋白基食品鑒定的靶向和非靶向分析中得到廣泛應用.Tenori等[29]人開發出了一種快速、可重復的牛奶核磁共振代謝組學指紋圖譜分析方法，使用偏最小二乘模型（PLS-CA）對不同農場出產的牛奶進行1H-NMR圖譜分析，發現不同農場的奶牛產出的牛奶其代謝物含量差異明顯，從而明確區分有機奶和非有機奶，以及識別不同品牌的牛奶.Longobardi等[30]使用核磁共振氫譜分析了不同地理來源的扁豆的代謝物，認為代謝譜中的異亮氨酸、丙氨酸、瓜氨酸、天冬氨酸、檸檬酸鹽等信號區域是鑒別扁豆地理來源的重要依據.

信噪比是信號強度與噪聲的比值，用于判斷NMR圖譜的質量.傳統NMR圖譜信噪比不高，在弱信號物質分析方面有很大缺陷，隨著技術進步，已經發展出多種高分辨核磁共振波譜法，例如脈沖傅里葉變換NMR、低場核磁共振及成像技術（LF-NMR-MRI）、高分辨率魔角旋轉核磁共振（HRMAS-NMR）、二維及多維核磁共振圖譜等.Sujatha等[31]對來自韓國奶牛場的52份奶酪樣品采用1H HRMAS-NMR分析，以找到奶酪樣品的代謝物分布和濃度與感官評價的相關性.多元統計分析結果表明，根據感官評價分組的奶酪，不同組之間氨基酸和有機酸含量差異顯著，是由不同加工過程中蛋白質水解和代謝造成，奶酪的1H HRMAS-NMR代謝指紋圖譜與感官品質評價一致.

1.6 X射線衍射法（X-ray diffraction，XRD）

晶體中的原子排列具有周期性，當用X射線照射晶體時，由于X射線的波長與原子面間的距離相近，不同的原子會對X射線產生不同方向的散射，散射的X射線相互干涉，從而形成衍射圖譜，這種方法稱為X射線衍射法.XRD可以得到蛋白晶體的原子結構信息，是目前研究蛋白質三維結構最常用的方法之一，據統計，蛋白質結構數據庫（PDB）儲存的90%左右蛋白質結構數據都是由XRD法測得[32].不同蛋白質其空間結構不一樣，具有特征性，因此XRD法非常適合用來構建蛋白質指紋圖譜，能得到更全面的蛋白質信息.蛋白基食品大多為非結晶態，其中含有較多較雜且大分子量的蛋白質，較難得到純的蛋白質晶體，但是利用XRD依然可以計算得到其結晶度、肽鏈距離、非結晶成分等信息.Chen等[33]通過XRD研究了不同高壓對肌原纖維蛋白粉的加工作用，在2θ值為20°時，發現明顯的非晶態結構峰，且隨著壓力的增加，達到15 000 psi時，肌原纖維結構完全被破壞，其非晶態結構峰值強度達到最低，表明加工后蛋白粉形成更多排列有序的晶體結構，但在壓力達到20 000 psi時，過度加工會破壞這些晶體結構，使得非晶態結構峰值強度升高.Zhang等從小牛皮中提取膠原蛋白，經過超聲處理后，使用XRD計算膠原蛋白分子鏈間的距離，根據布拉格方程：得到四種不同處理的膠原蛋白分子鏈間距離分別為1.197，1.190，1.187，1.180 nm；多肽鏈間的距離分別為0.285，0.281，0.287和0.292 nm.這些數據表明，超聲波以及膠原蛋白濃度對膠原結構不會產生影響.Zhu等[34]對比了從鰩魚和鱘魚軟骨提取的酸溶性膠原蛋白（ASC）和酶溶性膠原蛋白（PSC）的XRD圖譜，ASC和PSC都顯示含有兩個衍射峰，第一個尖峰出現在5°～10°，代表膠原蛋白分子鏈間的距離；第二個寬峰出現在20°，為膠原內非晶態區域的彌散散射形成.結合CD和XRD的數據分析，表明這兩種提取方法得到的膠原蛋白具有完整的三重螺旋結構.

XRD在蛋白質方面主要用于結構解析以及動態變化過程，目前發展出許多新型的X射線衍射技術，例如同步輻射X射線衍射、小角X射線衍射、廣角X射線衍射、X射線自由電子激光衍射等，不僅能夠更精確的表征蛋白質晶體，甚至有可能實現非晶體蛋白質的結構解析，因此，XRD是構建蛋白質指紋圖譜的潛在有力方法.

1.7 質譜法（Mass spectrography，MS）

質譜的原理是物質分子在離子源的轟擊下失去電子，并裂解為不同的陽離子，陽離子在電場和磁場雙重作用下，按照質荷比（m/z）大小依次排列成譜.質譜法如今已成為蛋白質組學和代謝組學研究的重要手段之一[35]，可以精確測定蛋白質相對分子質量、元素組成、碳骨架及官能團結構信息，這些信息恰恰是蛋白質的“指紋”，因此也可以采用MS法構建蛋白質指紋圖譜，用于食品的品質控制[36].質譜只能分析純品物質，復雜以及大分子量的樣品例如食品中的蛋白質則需要與高效液相色譜（HPLC）聯用才能進行分析，這使得HPLC-MS聯用成為蛋白質組學的主要方法.Gu等[37]通過超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道高分辨率質譜（UPLC-Q-Exactive-HRMS）分離大西洋鮭魚和虹鱒魚的酶解多肽，再通過三重四極桿質譜（LC-QQQ-MS）進行多反應監測（MRM）分析，篩選出5種特異性肽生物標記物.最后以是否含有特異性肽GDPGPGGPQGEQGVVGPAGISGDK，對不同地區和不同批次的37個真實樣品以及市售加工產品進行測試，檢測出2個大西洋鮭魚摻假樣品.Ma等[38]也采用了同樣的蛋白質組學方法鑒別食用燕窩及其摻假品.其篩選出的28個特異性肽標記物可用于區分燕窩與摻假品，這些特異性肽主要來源于酸性幾丁質酶、賴氨酰氧化酶3、I型膠原α1鏈和α2鏈、溶菌酶、卵鐵傳遞蛋白、卵清蛋白、ATP合成酶等.這為食品的摻假檢測提供了有效、可靠的策略.此外，還有人通過LC-MS/MS來構建膠原蛋白肽質量指紋圖譜，成功鑒定出11種魚類[39].

質譜根據離子源的不同可以分為電噴霧離子化質譜（ESI-MS）、熱噴霧離子化質譜（HEIMS）、二次離子質譜（SIMS）、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS），再搭配不同的質量分析器（四極桿、飛行時間、離子阱），可以實現不同的檢測需求.目前LC-MS和MS-MS串聯使用的方法在蛋白質結構分析以及多肽氨基酸特異性序列分析中應用較多，這種方法更靈敏、分辨率更高、更精確，甚至僅用一段多肽就能鑒別蛋白質.這說明可以通過特征肽段來構建蛋白質指紋圖譜[40]，用于食品蛋白質分析和鑒別.

2 色譜法

色譜法利用物質在流動相和固定相之間選擇性分配的原理，在流動相的推動下，混合物中各組分以不同速度沿固定相移動，從而達到分離的目的.與光譜法相比，色譜法在分離和定量分析特定物質方面更有優勢，在食品檢測領域應用最為廣泛.而蛋白質組學的興起，推動了色譜與質譜聯合應用技術的發展，使得高通量蛋白質檢測得以實現，可以對各種基質中成千上萬種蛋白質進行全面的定性和定量分析.目前已有許多學者將這種聯合技術應用于蛋白質指紋圖譜分析中，其中應用最多的是高效液相色譜-質譜聯用，其次還有高效薄層色譜-質譜聯用、高速逆流色譜-質譜聯用、高效毛細管電泳等.

2.1 高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS）

高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatograph，HPLC）具有的高壓、高速、高效、高靈敏度以及適用性強等特點，使得高效液相色譜成為如今應用最廣泛的分離檢測技術.在食品蛋白質的分離分析方面，體積排阻色譜法（SEC）和反相高效液相色譜法（RP-HPLC）應用最多，已有一些學者將其用于食品蛋白質指紋圖譜的構建，例如牛奶、水牛乳、蛤蟆油等.然而HPLC只是一種分離技術，能提供的蛋白質信息比較有限，HPLC-MS聯用則結合了兩者的優點，不僅可以對蛋白質做到快速的定性定量分析，還可以獲得蛋白質的分子質量和結構信息等，增強了蛋白質指紋圖譜的代表性[41].此外，HPLC-MS在多肽分析方面更是有獨到的優勢，有學者提出用肽質量指紋圖譜[36]鑒別蛋白質或食品.這種基于特征多肽的蛋白質鑒定思路是：先提取樣品中的蛋白質，將蛋白質進行酶解，得到多肽，經過高效液相色譜-高分辨率質譜檢測，并與蛋白質數據庫比對，篩選得到特征多肽，再通過HPLC-QQQ-MS和多反應監測方法得到特征多肽的總離子流圖譜進行驗證.Wong等[42]以HPLC-MS聯用法分析了不同品種和來源的燕窩及其摻假品的多肽指紋圖譜，其結果表明燕窩正品與摻假品多肽指紋圖譜差異顯著，并鑒定出燕窩中的兩種主要生物標記蛋白：Muc-5AC蛋白和AMCase蛋白.張淑霞等[43]結合HPLC-Q-Exactive-HRMS和HPLC-QQQ-MS篩選得到核桃、杏仁、大豆、花生的特征多肽，經過驗證，這種基于特征多肽的方法可以鑒別出核桃露、杏仁露中是否摻入了大豆或者花生蛋白，大豆和花生的最低檢出限分別為：1.3和6.8 mg/kg，具有較高的靈敏度.這為蛋白基食品的多肽指紋圖譜的構建提供了參考.

蛋白質指紋圖譜的準確性，取決于蛋白質在色譜中分離的效率.近年來，一些新型的HPLC技術已經發展起來，例如超高效液相色譜（UPLC），它具有比HPLC更好的分離效率和分辨率，在檢測領域上的應用逐年增多.Lu等[44]采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF-MS）構建了牛奶的多肽指紋圖譜，可以區分牛奶是否摻入了植物蛋白，準確率達到95%.液體牛奶和奶粉的蛋白質種類相似，當往牛奶中摻入奶粉，則很難被檢測出來，Du等[45]則建立了一種用UPLC-QTOF-MS檢測液體牛奶是否摻入奶粉的方法，其通過比較兩者的完整蛋白質指紋圖譜和肽指紋圖譜進行區分.此外，還有二維及多維HPLC-MS聯用技術，例如凝膠過濾色譜-HPLC-MS/MS技術.多維HPLC-MS具有更高的分辨率，峰容量的優點，可以實現對蛋白質的精確檢測，這對于食品蛋白質指紋圖譜的構建來說是非常有用的工具.

2.2 高效薄層色譜-質譜聯用法（HPTLC-MS）

高效薄層色譜（High performance thin layer chromatography，HPTLC）是采用特制的高效薄層板以及多級展開或分級展開等展開技術來提高薄層色譜的靈敏度和準確性的方法.如今HPTLC已具有數字掃描和自動化的優點，并且開發出可以直接從HPTLC板上洗脫樣品到質譜儀上的裝置——CAMAG[46]，使得HPTLC-MS聯用成為可能.Sherma[46]報道了一種使用HPTLC-ESI-MS/MS方法建立葡萄酒中酪蛋白和卵清蛋白酶解多肽的指紋圖譜，用以快速識別葡萄酒中是否含有過敏原.Esparza等[47]直接在TLC板上對α-氨基酸進行固定電荷衍生，再進行MALDI-MS分析，得到各α-氨基酸的Rf值色譜圖和質譜圖.結果表明，不同α-氨基酸均得到良好的分離，且這種衍生化后再進行MS分析方法的靈敏度很高，可以用于膳食中的氨基酸甚至寡肽的檢測.以上研究表明HPTLC-MS在蛋白質類的研究中具有較大的潛力，可以運用到食品中的蛋白質指紋圖譜的構建.

2.3 高速逆流色譜-質譜法（HSCCC-MS）

高速逆流色譜（High-speed countercurrent chromatography，HSCCC）利用流體動力學原理，通過控制螺旋管的方向與高速同步行星式運動產生一個二維力場，使相對移動的互不相溶的兩相（一相作為固定相，另一相作為流動相）在高速旋轉下實現高效的萃取頻率，最后使樣品組分按照不同的分配系數依次分離.HSCCC在天然產物的分離純化方面應用較多，由于其無不可逆吸附、無需色譜柱和能有效保護活性物質的優點，近年來在蛋白質和多肽分離純化研究方面的應用逐漸增多[48]，HSCCC-MS的聯用能夠更全面的分析蛋白質和多肽.Dong等[49]采用MCI凝膠柱層析-HSCCC-電噴霧高分辨串聯質譜法，從球蛋白多肽中分離純化得到高濃度的val-val-tyr-pro活性多肽.Li等[50]人利用HSCCC的反膠束溶劑體系來分離純化苦瓜中的蛋白質.MALDI-TOF/TOF-MS/MS成功鑒定出3種蛋白質（抗性蛋白P-B、五肽重復序列蛋白和具有抗癌作用的新型蛋白）.HSCCC的快速純化能力能夠滿足MS對蛋白質樣品純度的要求，兩者聯用可以實現快速對蛋白質進行鑒定，這對食品中蛋白質的分析以及蛋白質指紋圖譜的建立方面具有很大的應用潛力.

2.4 高效毛細管電泳（HPCE）

高效毛細管電泳（High performance capillary electrophoresis，HPCE）是一種以高壓電場為推動力，毛細管為分離通道，根據樣品各組分之間的淌度和分配行為的差異進行分離分析的方法，其結合了色譜和電泳兩種分離技術的優點.廣泛應用于蛋白質類藥物、生物液體蛋白質、食品蛋白質、農產品蛋白質的分析和質量控制等多個方面[51].張政等[52]人建立了以25個共有峰為代表的全蝎酶解液蛋白類成分（＞10 kDa）的HPCE指紋圖譜，可用于鑒別全蝎蛋白類成分.李克宏等[53]建立了不同產地核桃、杏仁、大豆、花生的HPCE蛋白質指紋圖譜，可作為摻假檢測.Bonke等[54]通過HPCE對新型植物蛋白飲料中的氨基酸和蛋白質組成進行了分析，可鑒定單一和混合型植物飲料.HPCE分析不需要大量有機試劑，且操作簡單快速，還可以同時分析多個樣品，節省時間成本，在高通量蛋白質分析領域上有著良好的應用前景.

綜上所述，光譜指紋圖譜技術和色譜指紋圖譜技術均適用于食品蛋白質的分析，兩者各有優點和不足（如表1）.而從近年來的發展趨勢看，多種技術的聯用將是構建食品蛋白質指紋圖譜的更好方法，能夠得到更全面的蛋白質信息，更能反映食品品質的變化，有助于食品生產過程中的質量控制.

表1 光譜法與色譜法指紋圖譜技術的比較

3 化學計量學在指紋圖譜方面的應用

化學計量學是一門通過統計學或數學方法將對化學體系的測量值與體系的狀態之間建立聯系的學科.它通過從相關和不相關的化學數據集合中提取有意義的信息來實現客觀的數據評估，這為光譜和色譜的數據分析提供了強有力的工具[55].在化學計量學中，有二個重要的組成部分，分別是相似度分析和多元統計分析.

3.1 相似度分析方法

相似度算法是一類用于評價多個樣本的向量或矩陣之間相似程度的算法總稱.包括夾角余弦法（inter-angle-cosine；vector cosine）[56]、相關系數法（correlation coefficient）[57]、重疊率系數法（overlap ratio coefficient）、最大-最小系數法（min-max coefficient）、歐氏距離法（euclidean distance analysis）[58]、馬氏距離法（mahalanobis distance analysis）[59]等.付江波等[56]對10批不同產地的藏藥八味秦皮丸的XRD指紋圖譜進行了相似度分析，分別采用了夾角余弦法和相關系數法計算該批樣品的相似度，結果表明采用夾角余弦法進行評價更為準確，可用于八味秦皮丸的鑒定和質量分析.

3.2 多元統計分析方法

多元統計分析方法在指紋圖譜的分析中應用最為廣泛，它能夠對樣品指紋圖譜進行綜合分析、特征剖析和數據挖掘.根據分析原理，可分為有監督分析方法和無監督分析方法.

3.2.1 無監督分析方法

無監督分析方法，其目的是得到樣品之間的聚類或分組關系，在不知道樣品類別的情況下，常使用該法將復雜的圖譜數據以分類樹或圖的形式轉換出來進行分析.在無監督方法中，主成分分析（PCA）是應用最為廣泛的分析方法，其他還有聚類分析（CA）、層次聚類（HCA）[60]、K-均值聚類（K-means）[61]、自組織映射人工神經網絡（SOM-ANN）[62]等.榮菡等[62]采用偏最小二乘法（PLS）和SOM-ANN法聯用，對牛乳和摻假乳的近紅外光譜指紋圖譜進行了分析和預測，SOM-ANN模型對未知樣品的識別準確率達到了95%，并將樣品分為了4類.表明SOM-ANN模型可用于食品的摻假鑒別.

3.2.2 有監督分析方法

有監督分析方法是指通過利用已知類別的樣本作為訓練集，進而建立分類模型，再使用模型對未知樣品進行預測、歸類的方法.這其中較為常用的有：線性判別分析（LDA）[63]、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）[45]、K最近鄰法（K-NN）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）[31]、簇類獨立軟模式分類法（SIMCA）[64]、人工神經網絡法（ANN）[65]、小波神經網絡法（WNN）、典型相關分析（CCA）[66]、支持向量機（SVM）[67]、貝葉斯判別法（Bayes-DA）、反向傳播人工神經網絡（BP-ANN）[68]等.

指紋圖譜可以說是反映分析樣品復雜化學成分的特征曲線，相比于其他檢測方法，其具有更大的信息量.化學計量學作為一種多變量數據分析工具，在處理整合大量信息方面有獨到的優勢.因此將食品蛋白質指紋圖譜與化學計量學相結合，能夠挖掘到更多有用的信息，在蛋白質食品摻假、溯源、品質鑒定、生產監測等方面將發揮巨大的作用.

4 結語及展望

蛋白質作為食品不可缺少的營養成分，在食品的生產過程中能夠保持相對穩定，且具有物種特異性，非常適合作為生物標志物.目前蛋白質指紋圖譜技術已廣泛用于物種鑒定、疾病診斷、藥物篩選、中藥指紋圖譜、食品質量控制等方面，已有20多年的發展歷史，尤其是近年來，隨著各種新型儀器和分析方法的涌現，各種蛋白質指紋圖譜技術不斷被開發用于食品安全和質量控制，可以預見，未來的食品安全和質量標準體系中必有蛋白質指紋圖譜的一席之地，這將有助于建立一個更加規范化、標準化的食品認證和監管體系.

為了更好的促進食品蛋白質指紋圖譜的發展，在此提出幾點建議：1.決定蛋白質指紋圖譜好壞的最關鍵一步是蛋白質提取技術，如何能夠快速并且高效的提取到蛋白質，涉及到縮短蛋白質指紋圖譜的時間成本和提高檢測效率.因此需要進一步開發簡便而有效的蛋白質提取技術，以實現實時無損快速檢測；2.食品蛋白質在整個生產過程中會有一定程度的變化，這是一個動態變化的過程，單從產品角度制作的蛋白質指紋圖譜已顯不足，應開發蛋白質動態指紋圖譜技術，用于追蹤食品的整個生產、銷售環節，這將會使食品的生產過程更加規范和標準化.3.建立蛋白質數據庫共享平臺，有助于提升蛋白質鑒定的效率.蛋白質指紋圖譜不僅可以用于食品安全和質量控制，也可以用于發現新的蛋白質和活性物質，進一步提高食品的附加值.