淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的敏感性及mtrR基因突變分析*

廖 娟，林 瀅，方 鳳，詹文芳，劉繼來(lái)

福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福州 350004

淋病奈瑟菌是性傳播疾病淋病的致病菌，其顯著特點(diǎn)是能迅速累積不同的突變，從而獲得對(duì)抗菌藥物的耐藥性[1]。自20世紀(jì)30年代中期開(kāi)始使用磺胺類藥物以來(lái)，淋病奈瑟菌對(duì)用于治療淋病的大部分抗菌藥物都產(chǎn)生了耐藥性[2]。世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦將頭孢菌素聯(lián)合阿奇霉素作為無(wú)并發(fā)癥淋病的一線藥物[3]，但不斷增加的耐藥性給淋病的治療帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，已經(jīng)出現(xiàn)淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素耐藥的相關(guān)報(bào)道[4-5]。本文通過(guò)檢測(cè)淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的耐藥性并對(duì)其相關(guān)耐藥基因mtrR進(jìn)行測(cè)序分析，以了解該菌的耐藥特征及耐藥機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集本院2018—2020年臨床分離的43株淋病奈瑟菌菌株，質(zhì)控菌株為ATCC49226。

1.2方法

1.2.1藥敏試驗(yàn) 采用瓊脂稀釋法檢測(cè)淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的最小抑菌濃度(MIC)，阿奇霉素購(gòu)于上海陶素生化科技有限公司，GC瓊脂粉購(gòu)于上海艾禮生物科技有限公司，無(wú)菌脫纖維羊血購(gòu)于廣州鴻泉生物科技有限公司。藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2020年標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2.2mtrR基因擴(kuò)增測(cè)序 選取對(duì)阿奇霉素非敏感的菌株(阿奇霉素非敏感組，MIC>1.000 μg/mL)和隨機(jī)挑選的10株對(duì)阿奇霉素敏感的菌株(阿奇霉素敏感組，MIC≤1.000 μg/mL)進(jìn)行基因組DNA提取，采用天根生物有限公司的基因組提取試劑盒，提取DNA后經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀確認(rèn)DNA濃度和純度后保存于-20 ℃冰箱備用。參考文獻(xiàn)[7]，由上海生工生物有限公司合成引物(mtrR-F:5′-GCCAATCAACAGGCATTCTTA-3′;mtrR-R:5′-GTTGGAACAACGCGTCAAAC-3′)。PCR試劑盒購(gòu)于Promega公司，反應(yīng)體系參考試劑說(shuō)明書(shū)，mtrR基因的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳獲取PCR產(chǎn)物后，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Bioedit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，利用ORF Finder進(jìn)行閱讀框架的翻譯；采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏試驗(yàn)結(jié)果 43株菌株中共檢出對(duì)阿奇霉素非敏感的菌株11株，對(duì)阿奇霉素敏感的菌株32株，阿奇霉素的非敏感率為25.6%(11/43)，其MIC結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的MIC結(jié)果

2.2mtrR基因的檢出情況及突變特點(diǎn) 選擇的21株菌株(11株對(duì)阿奇霉素非敏感，10株對(duì)阿奇霉素敏感)均擴(kuò)增出mtrR基因，部分標(biāo)本瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。其中阿奇霉素非敏感組在mtrR啟動(dòng)子區(qū)13 bp反向重復(fù)序列中A堿基缺失突變的比例為45.5%(5/11),而阿奇霉素敏感組A堿基缺失突變的比例為70.0%(7/10),兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。阿奇霉素非敏感組在mtrR編碼區(qū)發(fā)生突變的比例為54.5%(6/11,分別為菌株18010080、18011026、18015369、20014066、20018372、20019431)。阿奇霉素敏感組在mtrR基因編碼區(qū)發(fā)生突變的比例為50.0%(5/10，分別為菌株18015432、19003706、19015308、20006226、20007603)，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但可見(jiàn)阿奇霉素非敏感組在mtrR基因編碼區(qū)存在多個(gè)位點(diǎn)的突變。見(jiàn)表2。

注：M為標(biāo)志物；1～10分別為菌株18006276、18009808、18010080、18011026、18015369、18015432、19003706、19008415、19012656、19014501。

表2 mtrR基因突變情況

續(xù)表2 mtrR基因突變情況

3 討 論

淋病是由淋病奈瑟菌引起的一類性傳播疾病，男性的臨床表現(xiàn)為尿道炎，女性則表現(xiàn)為宮頸炎，嚴(yán)重者可導(dǎo)致盆腔炎、不孕癥及異位妊娠等不良后果。同時(shí)，淋病奈瑟菌感染還可能增強(qiáng)人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染和傳播[8]。2014年歐洲疾病預(yù)防控制中心的報(bào)告顯示，在2013—2014年淋病奈瑟菌的感染率增長(zhǎng)了25%[1]，由于目前還沒(méi)有針對(duì)淋病的疫苗，對(duì)淋病的控制主要依賴于流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和抗菌藥物的使用[9]。為提高治療效果，許多國(guó)家推薦采用頭孢曲松聯(lián)合阿奇霉素作為無(wú)并發(fā)癥淋病的一線治療藥物[10]。然而阿奇霉素耐藥菌株，特別是高度耐藥菌株已經(jīng)時(shí)有報(bào)道，大大降低了聯(lián)合用藥的有效性。因此，監(jiān)測(cè)淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的耐藥性，了解其耐藥機(jī)制，將有利于預(yù)防淋病奈瑟菌的傳播，延緩耐藥性的發(fā)生。本研究中的43例菌株對(duì)阿奇霉素的非敏感率為25.6%，MIC最大值可達(dá)64.000 μg/mL。臨床應(yīng)重視淋病奈瑟菌的耐藥性，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行治療用藥的選擇。

阿奇霉素是大環(huán)內(nèi)酯類藥物，主要通過(guò)與細(xì)菌核糖體50S亞基的23S rRNA結(jié)合，干擾信使核糖核酸(mRNA)翻譯，通過(guò)阻斷轉(zhuǎn)肽酶的作用，從而抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。研究表明，淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的耐藥機(jī)制主要涉及兩個(gè)方面：一個(gè)是藥物外排的加強(qiáng)，另一個(gè)是藥物靶點(diǎn)的改變。其中藥物外排的加強(qiáng)主要是由于mtrR基因發(fā)生突變導(dǎo)致。mtrR基因編碼mtrR蛋白，此蛋白可以負(fù)向調(diào)控外排泵，當(dāng)mtrR基因發(fā)生突變時(shí)，可以引起mtrR蛋白減少或缺失，從而導(dǎo)致細(xì)菌外排抗菌藥物的能力增強(qiáng)，使得細(xì)菌對(duì)阿奇霉素的敏感性下降[11]。有研究表明，mtrR基因啟動(dòng)子區(qū)域的A堿基缺失突變與阿奇霉素的MIC提高有關(guān)[12]，而mtrR基因編碼區(qū)發(fā)生的G45D替換突變也與細(xì)菌對(duì)阿奇霉素高度耐藥有關(guān)[13]。本研究中阿奇霉素非敏感組和阿奇霉素敏感組中均出現(xiàn)A堿基缺失突變，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而與阿奇霉素敏感組比較，阿奇霉素非敏感組在mtrR基因編碼區(qū)可見(jiàn)多個(gè)位點(diǎn)的突變,這與文獻(xiàn)[14]報(bào)道相似。但編碼區(qū)的替換突變?cè)趦山M之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能的原因是淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的耐藥機(jī)制除了mtrR基因突變作用之外，還與23S rRNA基因突變密切相關(guān)，此外rpID、rpIV等基因突變也可導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性升高[15]。不同的mtrR基因突變方式對(duì)淋病奈瑟菌的耐藥性所起的作用也可能不同[16]，有研究表明，mtrR基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生的缺失突變?cè)诹懿∧紊鷮?duì)阿奇霉素耐藥性中起的作用比mtrR基因編碼區(qū)發(fā)生的替換突變更為重要[17]。

綜上所述，淋病奈瑟菌對(duì)阿奇霉素的耐藥形勢(shì)較為嚴(yán)峻，mtrR基因發(fā)生突變可以使淋病奈瑟菌產(chǎn)生耐藥性，臨床應(yīng)該重視阿奇霉素的敏感性監(jiān)測(cè)及mtrR基因檢測(cè)，并根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選擇抗菌藥物，制訂合理措施來(lái)控制淋病奈瑟菌的播散。