AZF區微缺失檢測方法分析Y-STR基因座分型缺失現象*

賴 力，吳貽晨，陳 點，王堯城，劉尚龍

1.福建省立醫院司法鑒定所/福建省心血管病重點實驗室，福建福州 350001；2.福建醫科大學省立臨床醫學院，福建福州 350001；3.福建中醫藥大學第一臨床醫學院，福建福州 350001

Y染色體短串聯重復序列(Y-STR)作為一種特殊的遺傳標記，在法醫學個體識別和親緣鑒定方面具有不可或缺的作用，尤其是在父源關系鑒定方面，Y-STR基因座分型是判斷不同男性個體是否來自同一父系的主要依據。作為人類唯一的單倍體遺傳染色體，Y染色體易發生染色體內非等位性重組，因此Y-STR基因座比常染色體短串聯重復序列(STR)基因座具有較高的變異率。實踐中發現，部分Y-STR基因座存在分型缺失(又稱為無效擴增)現象，與Y染色體長臂或短臂上部分基因片段的缺失有密切關系，因此男性不育癥患者的Y染色體無精癥因子區域(AZF區)微缺失也可能是導致部分Y-STR基因座分型缺失的原因。

本研究對實驗室日常DNA-STR基因座檢測過程中發現的Y-STR基因座分型缺失的樣本進行Y染色體AZF區微缺失檢測，旨在探討由Y染色體AZF區微缺失造成的Y-STR基因座分型缺失對個體識別和父源關系鑒定的影響以及Y-STR基因座作為男性不育癥基因檢測方法的可行性，并且選擇合適的Y-STR基因座進行個體識別和父源關系鑒定。

1 資料與方法

1.1樣本來源 收集本實驗室日常進行個體識別以及親緣鑒定DNA-STR基因座檢測的個體，每人份采集EDTA抗凝血2 mL，-20 ℃保存。

1.2儀器與試劑 Y-STR基因座分型采用AGCU Y24、GFS 24Y檢測系統(無錫中德美聯公司)以及Promega Y23檢測系統(美國Promega公司)，主要儀器為Veriti擴增儀(美國AB公司)和3130型遺傳分析儀(美國AB公司)。Y染色體AZF區序列標簽(STS)位點檢測使用Y染色體微缺失檢測試劑盒(熒光PCR-毛細管電泳法，北京閱微基因技術公司)，主要儀器為Gen Reader基因分析儀(北京閱微基因技術公司)。

1.3方法 采用Chelex法提取DNA。Y-STR基因座復合擴增的體系配置和擴增循環參數參照各自試劑盒說明書，擴增產物的電泳分離和熒光檢測在3130型遺傳分析儀上進行，采用Data Collection 3.0軟件收集DNA片段的熒光信號，GeneMapper ID v3.2分析軟件進行數據分析，獲得43個Y-STR基因座分型結果。對存在Y-STR基因座分型缺失的個體進行AZF區STS位點檢測，檢測位點為SRY、ZFY、sY86、sY84、CDY2、SMCY、sY127、sY134、sY1161、sY1191、sY254、sY255、DAZ、sY157、CDY1、ZFX、SMCX、DAZL，反應體系20 μL，包含2.5×PCR Mix 8 μL；5×Y-Primer Mix 4 μL；模板DNA 1 μL(8.6 ng/μL)；無核酸酶純水7 μL。PCR擴增程序：(1)變性95 ℃，5 min；(2)擴增94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，1 min 30 s；30個循環；(3)延伸60 ℃，60 min；(4)4 ℃或15 ℃低溫保存。PCR擴增產物經毛細管電泳檢測，根據產物峰面積比例以及缺失情況確定Y染色體微缺失位點。

2 結 果

本研究共發現3例樣本存在Y-STR基因座分型缺失現象，其中1例樣本(編號1)采用GFS 24Y檢測系統發現DYS459和DYS527ab基因座分型缺失，用AGCU Y24檢測系統發現DYS527ab基因座同樣存在分型缺失(圖1)。進一步進行Y染色體微缺失檢測，結果顯示該樣本丟失sY255、sY1191、CDY1、sY254和DAZ等STS位點，經分析發現該樣本為AZFc區缺失(b2/b4)，見圖2。

注：A為GFS 24Y檢測系統;B為AGCU Y24檢測系統;畫圈處為分型缺失的基因座;橫軸處方框內數字表示基因座基因型,如DYS446基因座基因型為13，DYS443基因座基因型為13。

本研究還發現2例存在父子親緣關系樣本(編號2、3)的Y-STR基因座分型結果一致，均存在DYS522、DYS570和DYS576 3個基因座分型缺失，其余基因座分型為單倍型(圖3)。對兩份樣本進行Y染色體微缺失分析，結果顯示兩份樣本檢測結果一致，AZF區均未發現缺失，SRY基因均正常。

注：A為AGCU Y24檢測系統;B為Promega Y23 檢測系統;畫圈處為分型缺失的基因座;橫軸處方框表示基因座基因型,如Y GATA H4基因座基因型為12，DYS447基因座基因型為24。

3 討 論

Y染色體作為男性獨有的性染色體，具有單倍體父系遺傳的特點。除突變和缺失外，同一家族中所有男性個體的Y-STR基因座分型結果理論上應完全一致，這也是個體識別以及父源關系鑒定中判斷男性個體是否來自同一父系的主要手段。Y染色體的非重組區含有大量高度同源的重復序列，導致該區域結構高度不穩定，較容易發生染色體內非等位的同源性重組，從而導致Y染色體出現缺失、倒置和重復等結構異?，F象。多項研究報道了Y染色體上的遺傳標記Y-STR基因座分型缺失現象[1-5]。Y-STR基因座數據庫的建立，選擇的檢測位點數增多，更有助于發現分型異常及缺失[6]。

臨床研究表明，位于Y染色體的AZF區的缺失可能會導致無精癥或嚴重少精癥等男性不育癥的發生。Y染色體AZF區被劃分為AZFa、AZFb、AZFc 3個互相間隔的亞區，不同區域的AZF區缺失可對應導致無精癥或嚴重少精癥等男性不育癥的發生[7-9]。AZFa區缺失的患者主要臨床表現為唯支持細胞綜合征(SCOS)；AZFb區缺失的患者主要臨床表現為精子成熟過程停滯在精母細胞，出現成熟障礙；AZFc區缺失表現為不同程度的精子數量減少。葉峻杰等[10]研究報道，在中國漢族男性不育人群中，AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc區缺失的比例分別為5%、5%、15%和75%。本研究發現1號樣本也存在AZFc區缺失，由于樣本來源為未成年人，故無法對其生育能力進行鑒定。

AZF基因位于Y染色體Yq11區域，目前用于個體識別和父源關系鑒定的部分Y-STR基因座也位于該區域?，F有研究表明，AZFa區缺失的患者存在DYS437、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS439等位點的缺失，AZFb區缺失的患者存在DYS392、DYS385a/b、DYS549等位點的缺失，AZFc區缺失的患者存在DYS448、DYS527、DYS459等位點的缺失[11-12]。本研究發現3例Y-STR基因座分型缺失的個體，其中1號樣本發現DYS459和DYS527ab位點缺失，經AZF區STS位點檢測發現存在AZFc區的缺失，與王躍力等[12]的研究結果一致，表明上述Y-STR基因座可能位于Y染色體AZF區，故當AZF區STS位點存在微缺失時，與STS位點相關的Y-STR基因座也可能發生分型缺失。2號和3號這2例具有親緣關系的個體均發現DYS522、DYS570和DYS576 3個Y-STR基因座分型缺失，但AZF區STS位點檢測未發現缺失和異常，表明上述Y-STR基因座的分型缺失不是由AZF區STS位點微缺失所造成，可能是由Y染色體上其他區域的染色體片段缺失或者基因座引物結合區的堿基序列發生變異所導致。

鐵展暢等[13]研究報道，DYS449、DYS458、DYS481、DYS522、DYS570、DYS596、DYS627、DYS576等基因座缺失與位于Yp11.2區域的Amel-Y片段缺失具有一定相關性。本研究結果提示，Y染色體AZF區各類型STS位點的微缺失會引起DYS522、DYS570、DYS576、DYS549、DYS527ab等部分Y-STR基因座的分型缺失，說明該部分Y-STR基因座位于Y染色體AZF區內，與男性無精癥或嚴重少精癥等不育癥具有一定聯系。因此，在日常鑒定工作中發現上述Y-STR基因座分型存在部分或全部缺失的個體可以高度懷疑其AZF區存在微缺失，可增加Y染色體AZF區STS位點的檢測，以發揮Y-STR基因座作為分子遺傳標記物在遺傳疾病檢測方面的作用。目前該方面的研究較少，有待后續進一步擴大樣本量進行驗證。鑒于部分Y-STR基因座分型會受到AZF區微缺失等染色體疾病的影響，故在進行個體識別和父源關系鑒定時，應盡可能避免使用易發生缺失的Y-STR基因座進行分型檢測，實驗室應配備多套檢測試劑以備復核。