Th1、Th2、Th17相關細胞因子與兒童系統性紅斑狼瘡疾病活動程度的相關性研究*

王亞輝

盤錦遼油寶石花醫院兒科，遼寧盤錦 124010

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種自身免疫性和多系統性慢性炎性疾病，累及皮膚、關節、腎臟、肺和腦等[1]。SLE的發病機制尚未完全明確，主要涉及T細胞和B細胞的過度活躍、多克隆B細胞活化產生致病性自身抗體、自身抗原清除不良、免疫復合物沉積，以及血漿細胞因子異常等[2]。10%～20%的兒童系統性紅斑狼瘡(cSLE)起病于兒童期和青春期，發病率約為0.5/10萬，在免疫學和臨床表現等方面較成人SLE有許多不同之處[3]。且兒童發病隱匿，就診原因復雜、臨床表現多樣化，尤其是不典型、輕癥或處于疾病早期的cSLE患兒容易被誤診或漏診，因此尋找cSLE特異性免疫檢測指標和臨床指標對疾病的診斷十分重要。

細胞因子在調節免疫應答中起關鍵作用，其通常由T細胞、B細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞合成，在固有免疫和適應性免疫中誘導局部炎癥和全身急性期保護反應。研究表明，細胞因子信號轉導受損可導致自身免疫功能異常，并且能加劇疾病的嚴重程度[4]。輔助性T細胞(Th)亞群Th1、Th2和Th17產生的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6和IL-17等細胞因子在SLE的發病機制中發揮關鍵作用[5]。本研究通過分析Th亞群相關細胞因子的表達及其與疾病活動程度的相關性，探討cSLE疾病活動期的潛在生物標志物。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年12月于本院兒科就診的cSLE患兒47例作為觀察組。所有cSLE患兒均符合美國風濕病學會(ACR)1997年修訂的診斷標準。依據SLE疾病活動度評分(SLEDAI評分)將觀察組分為非活動期組(≤6分，18例)，活動期組(>6分，29例)。另選取同期來本院體檢的健康體檢兒童20例作為對照組。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象家屬均簽署知情同意書。與對照組比較，非活動期組和活動期組cSLE患兒紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、尿蛋白、抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA)水平和SLEDAI評分升高(P<0.05)，補體C3和C4水平有小幅降低,但差異無統計學意義(P>0.05)。與非活動期組比較，活動期組ESR、CRP、尿蛋白、anti-dsDNA水平和SLEDAI評分有不同程度上升(P<0.05)。3組年齡、性別構成比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組研究對象一般資料比較

1.2儀器與試劑 全自動血細胞分析儀和離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司，流式細胞儀FACS Canto購自美國BD公司。CD4+、CD8+T細胞亞群檢測試劑盒(流式細胞儀法-6色)購自碧迪醫療器械上海有限公司，人Th1/Th2/Th17亞群檢測試劑盒(流式熒光法)購自江西賽基生物有限公司，BD VacutainerTM血樣采集管和TrucountTM絕對計數管購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1Th1、Th2和Th17亞群相關細胞因子檢測 使用BD VacutainerTM采血管無菌采集靜脈血5 mL，2 000 r/min離心5 min，準備血漿標本0.5 mL。配置標準品：取300 μL標準品原液至300 μL樣品稀釋液中混勻，標記為管1，再從管1中取300 μL加至300 μL樣品稀釋液中混勻，標記為管2，如此倍比稀釋至稀釋度為1∶512。標本染色：捕獲微球混合液(A)1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入與上清液等體積的微球緩沖液(H)，混勻，避光30 min；混勻，每管加25 μL捕獲微球混合液；樣品管每管加25 μL待測血漿標本；標準品管每管加25 μL稀釋標準品；將熒光檢測試劑(C)按25 微升/管加至所有管中，混勻，避光2.5 h，每管加1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)，1 000 r/min離心5 min，棄上清液；每管加100 μL PBS，于流式細胞儀FACS Canto上機檢測。

1.3.2CD4+T和CD8+T細胞亞群檢測 取CD4+、CD8+T細胞亞群檢測試劑20 μL至BD TrucountTM絕對計數管內，用反向移液技術吸取抗凝全血50 μL，加入至BD TrucountTM絕對計數管，混勻，室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min，取450 μL BD流式細胞術(FACS)(1×)溶血素加入管中，混勻，室溫(20～25 ℃)避光孵育15 min，流式細胞儀FACS Canto上機檢測。

2 結 果

2.1cSLE患兒Th1、Th2和Th17亞群相關細胞因子水平 與對照組相比，非活動期組和活動期組cSLE患兒Th1亞群細胞因子TNF-α和干擾素(IFN)-γ，Th2亞群細胞因子IL-6和IL-10，Th17亞群細胞因子IL-17水平增加(P<0.05)。與對照組比較，活動期組Th2亞群細胞因子IL-4水平呈升高趨勢(P<0.05)。與非活動期組比較，活動期組IL-6、IL-10和IL-17水平升高(P<0.05)，IL-4、TNF-α和IFN-γ水平呈上升趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

注：A為Th1亞群；B為Th2亞群；C為Th17亞群；與對照組比較，aP<0.05；與非活動期組比較，bP<0.05。

2.2各組CD4+/CD8+比較 與對照組比較，活動期組cSLE患兒CD4+/CD8+降低(P<0.05)，非活動期組CD4+/CD8+僅小幅下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。非活動期組和活動期組CD4+/CD8+差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

注：與對照組比較，aP<0.05。

2.3cSLE患兒血清IL-6、IL-10水平與IL-17的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，cSLE患兒血清IL-6水平與IL-10、IL-17均呈正相關(r=0.415、0.497，P<0.05)。血清IL-10水平與IL-17水平呈正相關(r=0.402，P<0.05)。

2.4cSLE患兒血清IL-6、IL-10、IL-17水平與SLEDAI評分的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，cSLE患兒血清IL-6、IL-10、IL-17水平與SLEDAI評分均呈正相關(r=0.373、0.440、0.412，P<0.05)。

2.5ROC曲線分析 ROC曲線分析顯示：IL-6最佳臨界值為23.25 pg/mL，靈敏度為82.1%，特異度為84.2%，曲線下面積(AUC)為0.907(P<0.05)；IL-10最佳臨界值為32.50 pg/mL，靈敏度為78.6%，特異度為84.3%，AUC為0.853(P<0.05)；IL-17最佳臨界值為33.00 pg/mL，靈敏度為75.0%，特異度為63.2%，AUC為0.767(P<0.05)。

3 討 論

SLE是一種慢性自身免疫性疾病，其典型病理生理學機制涉及抗核抗體的產生，免疫復合物在全身基底膜中的沉積以及其引起的炎性反應[6]。cSLE呈現出的臨床表現和嚴重的并發癥，可能是由于促炎性細胞因子所致。持續且過量的細胞因子產生是自身免疫性疾病的標志，并且在疾病的發病機制中發揮重要作用[7]。研究發現，Th1通過產生IFN-γ介導針對細菌和病毒等微生物感染的免疫應答，但不受控制的Th1會導致多種自身免疫性疾病[8]。LI等[9]報道SLE和類風濕性關節炎(RA)等自身免疫性疾病患者血液中Th1亞群細胞因子IL-1β和IFN-γ、Th2亞群細胞因子IL-6、Th17亞群細胞因子IL-17A和IL-23水平均明顯升高，并提出細胞因子可能是監測和預測SLE嚴重程度的重要指標。本研究通過檢測cSLE患兒Th1、Th2和Th17亞群細胞因子的水平，分析高表達的細胞因子與疾病活動程度的相關性，探討預測cSLE疾病活動期的潛在生物標志物。

本研究結果顯示，cSLE患兒活動期組ESR、CRP、尿蛋白、anti-dsDNA水平相比對照組和非活動期組均有不同程度升高(P<0.05)。活動期CRP和ESR的升高提示疾病可能伴發感染或組織損傷；血清anti-dsDNA多屬IgG型抗體，其水平升高提示B細胞過度活化產生高滴度抗自身DNA和細胞核組分的抗體，可針對性攻擊自身組織，造成組織和器官的損傷；尿蛋白的檢出提示患兒出現腎臟損傷或腎功能減退，可能合并感染等并發癥。與對照組比較，活動期組cSLE患兒CD4+/CD8+降低(P<0.05)。cSLE患兒體內免疫復合物在臟器沉積，使駐留的免疫細胞數量增加，CD4+T細胞的Th1、Th2、Th17和調節性T細胞(Treg)等多個淋巴細胞亞群失衡。CD4+是直接反映機體免疫力的重要指標，CD4+/CD8+降低提示機體處于免疫失衡狀態，CD4+、CD8+的變化及CD4+/CD8+失衡在SLE的發病中起重要作用。細胞因子檢測結果顯示，與健康兒童相比，cSLE患兒Th1亞群TNF-α和IFN-γ，Th2亞群IL-6和IL-10，Th17亞群IL-17水平均有不同程度的增加(P<0.05)；疾病活動期IL-6、IL-10和IL-17水平較非活動期升高(P<0.05)。對本研究高度差異性表達的細胞因子IL-6、IL-10和IL-17的相關性分析發現，IL-6水平與IL-10、IL-17均呈正相關(r=0.415、0.497，P<0.05)，IL-10水平與IL-17呈正相關(r=0.402，P<0.05)。IL-6促進Th17分化并分泌IL-17，同時IL-17會促進IL-6的產生，Th17細胞途徑與IL-6之間存在正反饋回路。細胞因子IL-10在SLE中的致病機制存在爭議，通常認為IL-10促進了自身反應性B細胞的生長和分化[10]。IL-10水平與IL-6、IL-17呈正相關，提示三者可協同促進T和B細胞的自身免疫應答反應。血清IL-6、IL-10、IL-17與SLEDAI評分均呈正相關(r=0.373、0.440、0.412，P<0.05)，表明IL-6、IL-10、IL-17水平越高，SLE疾病活躍程度越高，病情越嚴重。ROC曲線顯示，3個細胞因子的早期檢測和定量分析有助于預測cSLE疾病活動度，可用于評估疾病的活躍度和惡性程度，且IL-6水平的預測效能高于IL-10和IL-17。

綜上所述，Th亞群細胞因子IL-6、IL-10和IL-17在cSLE的發病機制及疾病的發展中發揮重要作用。血清IL-6、IL-10和IL-17水平可作為cSLE患者疾病活動程度判斷的備選生物標志物。