紅花黃色素對高糖誘導小鼠足細胞損傷的影響及其機制

章 涵， 趙玉霞， 楊惠然， 董 雪

(信陽職業技術學院，河南 信陽 464000)

糖尿病腎病是臨床常見疾病類型，隨著病情發展可降低患者腎功能。蛋白濾過的最后屏障是足細胞，若其發生損傷可導致腎功能異常，進而促進糖尿病腎病的發生，故減輕其損傷成為治療糖尿病腎病的重要方法。研究表明，高血糖可引發氧化應激，從而加重腎損傷，最終促進糖尿病腎病發生[1-3]。紅花CarthamustinctoriusL.屬于菊科植物，其主要活性成分為紅花黃色素，具有抗炎、抗氧化應激、抗腫瘤等作用，并可保護心血管、神經系統[4]，但尚無關于該成分對足細胞損傷的作用。

長鏈非編碼RNA FGD5反義RNA 1(lncRNA FGD5-AS1)在牙周炎中表達下調，并可能通過調控miR-142-3p/細胞因子信號抑制分子6(SOCS6)分子軸從而減緩牙周炎的發展[5]。生物信息學分析顯示，微小RNA-302a-3p(miR-302a-3p)可能是FGD5-AS1的靶基因，在高糖誘導的腎小管上皮細胞中表達上調，并可能參與糖尿病腎病的上皮-間質轉化過程[6]。但紅花黃色素是否通過調控FGD5-AS1/miR-302a-3p通路而影響足細胞損傷尚不明確，故本實驗探討該成分對高糖誘導小鼠足細胞損傷的影響，分析其機制是否與調控FGD5-AS1/miR-302a-3p通路相關，以期為糖尿病腎病防治提供新方向。

1 材料

1.1 細胞 小鼠足細胞MPC5，購自美國ATCC公司。

1.2 試劑與藥物 紅花黃色素(批號180120)購自山東豐泰生物科技有限公司，采用無菌生理鹽水溶解紅花黃色素，制成質量濃度為30 mg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中保存。葡萄糖(批號G8270)、甘露醇(批號PHR1007)購自美國Sigma公司;亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-302a-3p寡核苷酸模擬物(miR-302a-3p mimics)及mimic 陰性對照序列(miR-NC)、FGD5-AS1小分子干擾RNA(si-FGD5-AS1)購自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑(批號20181003)購自上海聯邁生物工程有限公司；反轉錄(批號4387391)與熒光定量檢測試劑盒(批號4385612)購自美國Thermo Fisher公司；MTT(批號20181102)購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒(批號20171216)購自蘇州宇恒生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(批號A21020)購自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗鼠活化的半胱氨酸蛋白酶12(cleaved caspase-12)(批號2202)、脫氧核糖核酸修復酶降解產物(cleaved-PARP)抗體(批號5625)、兔抗鼠C/EBP環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白(CHOP)(批號5554)、磷酸化真核細胞起始因子(p-eIF2α)(批號9721)購自美國CST公司；葡萄糖調節蛋白78(GRP78)抗體(批號sc-13539)購自美國Santa Cruz公司。

1.3 儀器 Multiskan Sky 酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；FACS Calibur流式細胞儀購自北京艾格斯生物科技有限公司；StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

2 方法

2.1 分組 MPC5細胞接種于6孔板(每孔3×104個)，分為對照組(含5.5 mmol/L葡萄糖的培養基孵育48 h)、甘露醇組(含19.5 mmol/L 甘露醇、5.5 mmol/L 葡萄糖的培養基共同培養48 h)、高糖組(含25 mmol/L葡萄糖的培養基孵育48 h)[7]及高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組(含有25 mmol/L 葡萄糖與0.5、1、2 μmol/L紅花黃色素的培養基共同處理48 h)[8]。后續實驗分組為高糖+pcDNA組(pcDNA轉染至小鼠足細胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養基培養48 h)、高糖+pcDNA-FGD5-AS1組(pcDNA-FGD5-AS1轉染至小鼠足細胞，加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養基培養48 h)、高糖+紅花黃色素高劑量+si-NC組(si-NC轉染至小鼠足細胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖與2 μmol/L紅花黃色素的培養基共同處理48 h)、高糖+紅花黃色素高劑量+si-FGD5-AS1組(si-FGD5-AS1轉染至小鼠足細胞，含有5.5 mmol/L葡萄糖與2 μmol/L紅花黃色素的培養基共同處理48 h)。

2.2 MTT檢測細胞增殖 收集各組MPC5細胞接種于96孔板(每孔1×104個)，每孔添加20 μL MTT溶液，孵育4 h后4 ℃、2 000 r/min離心10 min，吸棄上清，每孔添加150 μL DMSO，25 ℃下避光振蕩5 min，檢測各孔在490 nm波長處的光密度(OD)值。存活率=(實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 預冷PBS洗滌各組MPC5細胞2次，取500 μL結合緩沖液加到細胞沉淀中，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，25 ℃下避光孵育10 min，流式細胞儀檢測MPC5細胞凋亡率。

2.4 RT-qPCR檢測細胞中FGD5-AS1、miR-302a-3p的表達 Trizol法提取MPC5細胞總RNA，反轉錄合成cDNA后配置反應體系。反應體系為10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL正向引物、0.4 μL反向引物、1 μL cDNA、8.2 μL ddH2O。FGD5-AS1以GAPDH為內參，miR-302a-3p以U6為內參，采用2-ΔΔCT法計算FGD5-AS1、miR-302a-3p相對表達量。

2.5 雙熒光素酶報告基因檢測FGD5-AS1的靶基因 分別將FGD5-AS1野生熒光素酶報告載體(WT-FGD5-AS1)、突變載體(MUT-FGD5-AS1)與miR-NC或miR-302a-3p mimics共轉染至MPC5細胞，收集轉染48 h細胞，檢測熒光素酶活性。

2.6 Western blot檢測cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達 MPC5細胞加入RIPA裂解液裂解細胞提取細胞總蛋白，SDS-PAGE分離蛋白，轉膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，在25 ℃下分別孵育一抗(1∶1 000稀釋)2 h，再孵育二抗(1∶5 000稀釋)2 h。曝光，顯影，Image J軟件分析各條帶相對內參GAPDH的灰度值。

3 結果

3.1 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞增殖及凋亡的影響 與對照組比較，甘露醇組細胞存活率、凋亡率、cleaved caspase-12、cleaved-PARP蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，表明高滲對細胞活性的影響較小，即可排除高滲對細胞活性的影響；與甘露醇組比較，高糖組細胞存活率降低(P<0.05)，cleaved caspase-12和cleaved-PARP蛋白表達、凋亡率升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組細胞存活率升高(P<0.05)，cleaved caspase-12和cleaved-PARP蛋白表達、凋亡率降低(P<0.05)，見圖1、表1。

表1 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞增殖及凋亡的影響

注：A為流式細胞術檢測紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞凋亡率的影響，B為Western blot法檢測紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞cleaved caspase-12以及cleaved-PARP蛋白表達的影響。

3.2 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞內質網應激損傷的影響 與對照組比較，甘露醇組細胞CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達無明顯變化(P>0.05)，即可排除高滲對細胞內質網應激的影響；與甘露醇組比較，高糖組CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達降低(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞內CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達的影響

表2 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞內質網應激損傷的影響

3.3 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞FGD5-AS1、miR-302a-3p表達的影響 與對照組比較，甘露醇組細胞FGD5-AS1、miR-302a-3p的表達無明顯變化(P>0.05)，即可排除高滲對細胞內FGD5-AS1、miR-302a-3p表達的影響；與甘露醇組比較，高糖組FGD5-AS1表達降低(P<0.05)，miR-302a-3p表達升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+紅花黃色素低、中、高劑量組FGD5-AS1表達升高(P<0.05)，miR-302a-3p表達降低(P<0.05)，見表3。

表3 紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞FGD5-AS1、miR-302a-3p表達的影響

3.4 FGD5-AS1過表達對高糖誘導的MPC5細胞增殖、凋亡及內質網應激損傷的影響 與高糖+pcDNA組比較，高糖+ pcDNA-FGD5-AS1組細胞存活率升高(P<0.05)，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α以及GRP78蛋白表達、凋亡率降低(P<0.05)，見圖3、表4。

表4 FGD5-AS1過表達對高糖誘導的MPC5細胞增殖、凋亡及內質網應激損傷的影響

注：A為流式細胞術檢測FGD5-AS1過表達對高糖誘導的MPC5細胞凋亡率的影響，B為Western blot法檢測FGD5-AS1過表達對高糖誘導的MPC5細胞中cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達的影響。

3.5FGD5-AS1靶向調控miR-302a-3pstarBase預測顯示FGD5-AS1與miR-302a-3p存在結合位點，見圖4。與WT-FGD5-AS1共轉染時，與miR-NC組比較，miR-302a-3p組熒光素酶活性降低(P<0.05)；與MUT-FGD5-AS1共轉染時miR-NC組與miR-302a-3p組熒光素酶活性比較，熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)，見表5。pcDNA-FGD5-AS1組miR-302a-3p的表達低于pcDNA組(P<0.05)；si-FGD5-AS1組miR-302a-3p的表達高于si-NC組(P<0.05)，見表6。

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 FGD5-AS1靶向調控miR-302a-3p的表達

圖4 FGD5-AS1與miR-302a-3p的結合位點

3.6 干擾FGD5-AS1表達可降低紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞增殖、凋亡及內質網應激的作用 與高糖+紅花黃色素高劑量+si-NC組比較，高糖+紅花黃色素高劑量+si-FGD5-AS1組細胞存活率降低(P<0.05)，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α及GRP7蛋白表達、凋亡率升高(P<0.05)，見圖5、表7。

圖5 干擾FGD5-AS1表達聯合紅花黃色素對cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達的影響

表7 干擾FGD5-AS1表達可降低紅花黃色素對高糖誘導的MPC5細胞增殖、凋亡及內質網應激的作用

4 討論

糖尿病腎病是引起終末期腎病的重要原因之一，其發病機制尚未完全闡明，其主要病理特征為腎小球基底膜增厚，足細胞損傷是糖尿病腎病發生的重要原因之一，高糖處理足細胞后可增加細胞凋亡率，研究表明小柴堿等中藥可通過維持足細胞功能穩定性從而減緩糖尿病腎病的發展[9-10]。lnRNA表達異?？赏ㄟ^競爭性結合miRNA從而參與糖尿病腎病、心血管疾病等多種疾病發生及發展過程[11]。關于紅花黃色素治療糖尿病腎病的作用機制及其可能作用靶點尚未闡明。

紅花黃色素屬于類黃酮化合物，其可用于治療腦血管疾病等炎癥性疾病，研究顯示紅花黃色素可有效控制肺纖維化發展進程，并可抑制肝癌、乳腺癌細胞增殖及促進細胞凋亡[12-14]。本研究結果顯示高糖處理后小鼠足細胞存活率降低，并可促進cleaved caspase-12以及cleaved PARP的表達，促進細胞凋亡，而不同濃度的紅花黃色素處理后MPC5細胞存活率升高，細胞凋亡率降低，并可抑制cleaved caspase-12、cleaved PARP的表達，且隨著藥物劑量的增加而逐漸變化。當細胞受到凋亡信號刺激時caspase-12被激活剪切為cleaved caspase-12并誘導細胞凋亡，PARP屬于細胞凋亡促進因子，其活化形成cleaved-PARP從而促進細胞凋亡[15-16]。提示高糖可誘導小鼠足細胞凋亡及抑制細胞增殖，而紅花黃色素可抑制高糖誘導的小鼠足細胞凋亡及促進細胞增殖。內質網應激的重要指標是CHOP、p-eIF2α、GRP78，研究表明內質網應激是引起細胞凋亡的重要途徑之一，內質網應激發生時GRP78的生成量增加并可激活CHOP、caspase-12從而誘導細胞凋亡，而PERK與GRP78解體后可激活eIF2α形成p-eIF2α從而促進CHOP表達最終誘導細胞凋亡[17]。本研究結果顯示高糖誘導的MPC5細胞中CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達升高，而紅花黃色素能降低CHOP、p-eIF2α、GRP78蛋白表達，且隨著藥物劑量的增加而逐漸降低，提示紅花黃色素可能通過抑制高糖誘導的小鼠足細胞內質網應激從而抑制細胞凋亡。

FGD5-AS1在OGD/R誘導的神經細胞中表達下調，上調其表達可能通過充當miR-223的海綿分子從而減輕神經元損傷[18]。本研究結果顯示高糖誘導的MPC5細胞中FGD5-AS1的表達降低，而不同濃度的紅花黃色素處理后小鼠足細胞中FGD5-AS1的表達升高，提示紅花黃色素的保護作用可能依賴于FGD5-AS1表達增加。FGD5-AS1過表達后高糖誘導的小鼠足細胞存活率升高，凋亡率降低，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α、GRP78表達下調，提示FGD5-AS1在糖尿病腎病足細胞損傷中可能發揮保護作用。同時本研究進一步分析顯示FGD5-AS1可靶向結合miR-302a-3p，并可負向調控miR-302a-3p的表達，高糖誘導的MPC5細胞中miR-302a-3p的表達升高，而不同濃度的紅花黃色素處理后miR-302a-3p表達降低，且隨著藥物劑量的增加而逐漸降低，提示紅花黃色素可能通過調控FGD5-AS1與miR-302a-3p表達從而對小鼠足細胞發揮保護作用。本研究結果顯示干擾FGD5-AS1表達與紅花黃色素共同處理后，高糖誘導的MPC5細胞存活率降低，cleaved caspase-12、cleaved-PARP、CHOP、p-eIF2α以及GRP7蛋白表達上調，凋亡率升高。提示干擾FGD5-AS1表達可減弱紅花黃色素對高糖誘導小鼠足細胞損傷的保護作用。

綜上所述，紅花黃色素可通過抑制內質網應激和細胞凋亡來減輕高糖誘導的小鼠足細胞損傷，其作用機制可能與上調FGD5-AS1/miR-302a-3p途徑有關。這為闡釋紅花黃色素治療糖尿病腎病的分子機制奠定實驗基礎，還可為明確FGD5-AS1在糖尿病腎病發生過程中的作用機制提供參考依據。