基于UPLC-QqQ-MS技術(shù)的黃柏生品及其鹽炙品中10種成分量的變化

李 麗， 張 超， 鄭 威， 于穎琦， 張 凡， 高 慧

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

黃柏，習(xí)稱(chēng)川黃柏，為蕓香科植物黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid的干燥樹(shù)皮，味苦性寒，具有清熱燥濕、解毒療瘡、瀉火除蒸的功效[1]。黃柏中含有大量生物堿類(lèi)、檸檬苦素類(lèi)成分，其中生物堿類(lèi)作為主要的活性成分[2]，包括黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿等，具有抗炎[3]、抑菌[4]、調(diào)節(jié)代謝[5]、抗氧化[6]等藥理作用。小檗紅堿作為黃柏鹽炙過(guò)程中由小檗堿轉(zhuǎn)化新生成的成分，同樣具有抗炎、抑菌的功效[3]，同時(shí)巴馬紅汀、藥根紅堿作為實(shí)驗(yàn)室自制成分，由巴馬汀、藥根堿分別轉(zhuǎn)化而得，與小檗紅堿具有相似的化學(xué)轉(zhuǎn)化歷程，推測(cè)其與小檗紅堿具有相似的藥理作用，故本研究將小檗紅堿、巴馬紅汀、藥根紅堿也作為含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。此外，黃柏藥材中還含有檸檬苦素類(lèi)成分黃柏酮和黃柏內(nèi)酯，黃柏味苦性寒，苦味藥多用治熱證，具有清熱燥濕、瀉火的功效，檸檬苦素類(lèi)與生物堿類(lèi)成分均是黃柏具有苦味的原因[7]，同時(shí)具有抗菌[8]、抗炎[9]、抗癌[10]等藥理活性，因此本實(shí)驗(yàn)亦將黃柏酮與黃柏內(nèi)酯納入指標(biāo)，以期更加全面的評(píng)價(jià)黃柏飲片。

目前測(cè)定黃柏中生物堿類(lèi)、檸檬苦素類(lèi)成分含量的測(cè)定方法主要是HPLC法[7, 11]，其不足之處主要是需要在2個(gè)色譜條件下分別測(cè)定這兩類(lèi)成分，且黃柏藥材中各成分之間含量差異大，實(shí)驗(yàn)室前期曾采用液相色譜法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)各成分間相互干擾嚴(yán)重，多種成分含量同時(shí)測(cè)定色譜條件摸索困難，而UPLC-QqQ-MS作為一種新的分析技術(shù)，其質(zhì)譜采用特定離子對(duì)掃描模式，可以通過(guò)提取質(zhì)量色譜圖準(zhǔn)確鑒別化合物，克服了液相色譜分離度差的問(wèn)題，靈敏度高，在短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到有效分離[12]，擁有更低的定量下限[13]，節(jié)約時(shí)間與成本。

古代醫(yī)籍中關(guān)于黃柏炮制方法較為豐富，醫(yī)者多會(huì)根據(jù)臨床使用的需要而選取不同的輔料和方法對(duì)其加以炮制。現(xiàn)今對(duì)于黃柏的炮制方法研究多集中在鹽黃柏、酒黃柏、黃柏炭等幾個(gè)炮制品種，并報(bào)道其含有的化學(xué)成分在炮制的過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)明顯的質(zhì)變和量變的情況[14]。鹽炙法是傳統(tǒng)中藥炮制方法之一，也是目前黃柏的主流炮制方法，鹽黃柏始載于《雷公炮炙論》，2020年版《中國(guó)藥典》沒(méi)有明確的炒制時(shí)間與炒制溫度，為了有效控制鹽黃柏飲片的質(zhì)量，并進(jìn)一步研究鹽黃柏在炒制過(guò)程中活性成分量變規(guī)律，故本實(shí)驗(yàn)中采用UPLC-QqQ-MS法對(duì)黃柏生品及其不同炒制程度的鹽炙品中10種成分進(jìn)行含量測(cè)定，以發(fā)現(xiàn)不同炒制溫度、炒制時(shí)間鹽黃柏中活性成分量變規(guī)律，并為鹽黃柏質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC/Xevo TQD超高效液相色譜串聯(lián)飛行質(zhì)譜儀(美國(guó)Waters公司，包括MassLynx 4.1工作站)；FA1004B型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；AE240型分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Milli-Q型超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 木蘭花堿(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkq16050801)；鹽酸小檗堿、鹽酸藥根堿(均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為MUST-16031814、MUST-16040702)；鹽酸巴馬汀(上海圻明生物科技有限公司，批號(hào)151120)；小檗紅堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮、黃柏堿(大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)分別為A1107AS、M0606AS、F0102AS、M0107AS)；巴馬紅汀及藥根紅堿均為實(shí)驗(yàn)室自制(純度>98%)；無(wú)碘鹽(購(gòu)自大連鹽業(yè)有限公司)。質(zhì)譜級(jí)甲醇、乙腈均購(gòu)于日本Sigma公司，色譜級(jí)甲醇，水為超純水，其他試劑均為分析純。

黃柏藥材購(gòu)自四川雅安，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為蕓香科植物黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹(shù)皮。

2 方法

2.1 炮制品制備

2.1.1 生黃柏 取黃柏原藥材，洗凈，潤(rùn)透，切細(xì)絲，干燥，即得。

2.1.2 不同炮制程度的鹽黃柏 取生黃柏，放入適宜的容器中，加鹽水拌勻(每100 g黃柏使用2 g食鹽)，悶潤(rùn)2 h，使得輔料鹽水被黃柏吸盡，在炒制容器內(nèi)于130～140、150～160、170～180 ℃下分別炒制3、4、5、6、7 min，取出，放涼，即得。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮對(duì)照品置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，制備成質(zhì)量濃度分別為0.091 2、0.031、0.010 5、0.049、0.002 9、0.137 25、0.001 275、0.418、0.088、0.004 85 mg/mL混合對(duì)照品溶液，4 ℃冷藏，備用。

2.2.2 供試品溶液 取生黃柏、不同炒制程度鹽黃柏適量，粉碎，過(guò)60目篩，分別精密稱(chēng)取0.2 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL 1%醋酸甲醇溶液，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲(250 W，40 kHz)處理30 min，取出，放冷，用1%醋酸甲醇溶液補(bǔ)足失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量0.25 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(ESI源)，正離子掃描模式；離子掃描范圍m/z50～1 000；毛細(xì)管電離電壓3.5 kV；源溫度150 ℃；脫溶劑溫度250 ℃；脫溶劑氣體體積流量800 L/h；錐孔氣體體積流量50 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)。10種成分的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2，MRM模式下的色譜圖、總離子流圖見(jiàn)圖1～2。

表2 黃柏中10種成分質(zhì)譜MRM模式下參數(shù)

1.黃柏堿 2.木蘭花堿 3.藥根紅堿 4.藥根堿 5.巴馬紅汀 6.小檗紅堿 7.巴馬汀 8.小檗堿 9.黃柏內(nèi)酯 10.黃柏酮

1.黃柏堿 2.木蘭花堿 3.藥根紅堿 4.藥根堿 5.巴馬紅汀 6.小檗紅堿 7.巴馬汀 8.小檗堿 9.黃柏內(nèi)酯 10.黃柏酮

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.02、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL，加入適量甲醇溶液，定容至10 mL，制備成系列混合對(duì)照品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下測(cè)定，并記錄各測(cè)定成分峰面積，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分線(xiàn)性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮峰面積RSD分別為2.67%、2.01%、2.02%、1.78%、1.55%、1.01%、0.98%、0.97%、1.23%、1.11%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一鹽黃柏供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、24 h，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮峰面積RSD分別為1.34%、1.56%、0.99%、2.03%、2.22%、1.75%、1.64%、1.44%、1.43%、0.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一批鹽黃柏樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，測(cè)得黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮含量RSD分別為1.30%、1.34%、1.21%、1.45%、1.34%、1.31%、0.99%、1.76%、1.89%、2.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的鹽黃柏樣品0.1 g，平行6份，精密稱(chēng)定，分別精密加入對(duì)照品適量(與0.1 g鹽黃柏樣品成分含量相當(dāng))，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下測(cè)定含量，計(jì)算回收率。黃柏堿、木蘭花堿、藥根紅堿、藥根堿、巴馬紅汀、小檗紅堿、巴馬汀、小檗堿、黃柏內(nèi)酯、黃柏酮的平均回收率分別為100.55%、99.83%、97.68%、99.78%、97.24%、100.46%、97.88%、102.23%、99.61%、96.79%，RSD分別為0.61%、0.01%、0.66%、0.13%、0.26%、0.79%、0.37%、0.41%、0.48%、0.36%。

2.6 樣品含量測(cè)定 分別精密稱(chēng)取生黃柏、不同炒制程度鹽黃柏粉末0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”“2.4”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，計(jì)算各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4、圖3。

表4 生黃柏及不同炒制程度鹽黃柏各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

圖3 黃柏生品、鹽炙品中各成分變化趨勢(shì)圖

3 結(jié)果

由含量測(cè)定結(jié)果可知，鹽黃柏炒制過(guò)程中黃柏堿、木蘭花堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿、及黃柏內(nèi)酯6種成分的含量整體呈下降趨勢(shì)，尤其在170～180 ℃炒制溫度下6種成分的含量下降最為顯著；巴馬紅汀、小檗紅堿、藥根紅堿3種成分含量整體呈上升趨勢(shì)，尤其在170～180 ℃炒制溫度下3種成分含量上升最為顯著；黃柏酮在170～180 ℃、炒制4 min時(shí)含量較高。

在炒制溫度130～140 ℃、炒制時(shí)間6～7 min條件下檢測(cè)到新成分巴馬紅汀，且在170～180 ℃、3 min條件下巴馬紅汀含量最高，同一炒制時(shí)間下，高溫較低溫條件下巴馬紅汀的含量更高；小檗紅堿含量隨著炒制時(shí)間和炒制溫度增加整體呈上升趨勢(shì)，小檗堿含量呈下降趨勢(shì)，在170～180 ℃、6～7 min條件下小檗堿含量降低最為明顯；藥根紅堿含量隨著炒制時(shí)間和炒制溫度的增加整體呈上升趨勢(shì)，藥根堿含量隨著炒制時(shí)間的增加整體呈降低趨勢(shì)，在170～180 ℃、6～7 min條件下藥根堿含量降低最為顯著。

4 討論

不同炮制程度的鹽黃柏在炮制過(guò)程中，顏色由黃色逐漸變?yōu)榧t褐色，提示著黃柏中的化學(xué)成分可能發(fā)生了變化[15]，在前期研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)黃柏在炮制過(guò)程其小檗堿成分發(fā)生了質(zhì)變，且隨著炮制溫度的升高、時(shí)間的延長(zhǎng)，鹽炙黃柏中部分鹽酸小檗堿轉(zhuǎn)化為小檗紅堿[16]，此反應(yīng)的發(fā)生條件在120 ℃以上[17]，且溫度控制在180 ℃、炒制時(shí)間控制在8 min時(shí)小檗紅堿的含量最高；而此外黃柏中藥根堿、巴馬汀等成分同為小檗原堿型生物堿，化學(xué)結(jié)構(gòu)構(gòu)型與小檗堿成分類(lèi)似，故推測(cè)黃柏在炮制前后其藥根堿、巴馬汀成分與小檗堿一樣也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的化學(xué)變化。實(shí)驗(yàn)室后期對(duì)藥根堿和巴馬汀化學(xué)成分單體進(jìn)行了模擬炮制研究，發(fā)現(xiàn)黃柏在鹽炙過(guò)程中藥根堿、巴馬汀成分與小檗堿一樣發(fā)生了類(lèi)似的化學(xué)反應(yīng)歷程，即為藥根堿轉(zhuǎn)化為藥根紅堿[18]，巴馬汀轉(zhuǎn)化為巴馬紅汀。從目前的文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看尚未見(jiàn)有對(duì)黃柏鹽炙過(guò)程中藥根紅堿和巴馬紅汀2種新成分量變變化研究的報(bào)道，基于此，本實(shí)驗(yàn)采取了溫度為130～180 ℃、炒制時(shí)間3～7 min的炮制條件，使用UPLC-QqQ-MS法，在正離子模式下同時(shí)測(cè)定了黃柏生品及其鹽炙品中生物堿類(lèi)和檸檬苦素類(lèi)共10種成分，同時(shí)包含了2種新生成成分，以期可為黃柏飲片及其制劑成分的分析和質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)表明，黃柏經(jīng)鹽炙后其化學(xué)成分發(fā)生了量變和質(zhì)變，從而也會(huì)對(duì)黃柏體內(nèi)代謝產(chǎn)物和入血成分產(chǎn)生相應(yīng)的影響，最終導(dǎo)致其藥性和功效的變化。在闡釋黃柏炮制原理的過(guò)程中，以單一成分的改變并不能很好的表征整個(gè)黃柏炮制過(guò)程的功效和藥性變化，故本實(shí)驗(yàn)采用了液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)黃柏中生物堿類(lèi)和檸檬苦素類(lèi)10種成分的量變變化進(jìn)行了全面分析。但為了更深入的解析鹽黃柏的炮制原理，還應(yīng)結(jié)合體內(nèi)代謝、吸收過(guò)程的考察，運(yùn)用現(xiàn)代聯(lián)用技術(shù)，分析黃柏鹽炙過(guò)程中活性成分經(jīng)體內(nèi)Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝的產(chǎn)物分析鑒定，建立一種快速有效的黃柏代謝產(chǎn)物分析方法，為進(jìn)一步明確鹽黃柏在體內(nèi)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量控制的研究奠定基礎(chǔ)，也為鹽黃柏的藥理活性研究以及臨床上的開(kāi)發(fā)利用提供參考。