骨康膠囊對大鼠肝臟藥物轉運體蛋白表達的影響

李 靖， 賀亞都， 王愛民， 李勇軍， 鄭 林， 劉 亭*

(1.貴州醫(yī)科大學，貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004；4.銅仁市萬山區(qū)人民醫(yī)院，貴州 銅仁 554200；5.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司，貴州 修文 550200)

在肝臟表面廣泛分布著高表達的攝取型和外排型轉運體[1-2]。攝取型轉運體主要包括有機陰離子轉運多肽(organic anion-transporting polypeptide，OATP)、有機陰離子轉運體(organic anion transporter，OAT)、有機陽離子轉運體(organic cation transporter，OCT)等，外排型轉運體主要包括乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated proteins，MRPs)等[3-5]。越來越多的研究表明，肝臟轉運體的活性或表達量決定著藥物的代謝命運，直接影響到藥物的攝入和清除[6]。因此，研究藥物對肝臟轉運體的活性或表達，對于闡明藥物間的相互作用，指導臨床用藥具有重要意義。骨康膠囊是貴州傳統(tǒng)苗藥復方制劑，主要由補骨脂、三七、續(xù)斷、芭蕉根和酢漿草組成，具有滋補肝腎、強筋壯骨、通絡止痛等功效[7-8]，常與其他藥物聯(lián)用于骨性關節(jié)炎、骨折、骨質疏松癥的治療[9-11]。目前尚無關于骨康膠囊影響藥物轉運體活性或表達的報道。為更好地指導骨康膠囊臨床應用，本實驗從蛋白表達的角度，研究骨康膠囊對大鼠肝臟藥物轉運體有機陽離子轉運體1(organic cation transporter 1，OCT1)、有機陰離子轉運多肽1B1(organic anion-transporting polypeptide 1B1，OATP1B1)、多藥耐藥相關蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1，MRP1)、多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)表達的影響，期望為避免骨康膠囊潛在的藥物相互作用提供參考。

1 材料

1.1 動物 24只健康雄性SD大鼠，體質量200～250 g，購自長沙天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(湘)2014-0011。研究經貴州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準(批準號1503017)。

1.2 試劑與藥物 骨康膠囊(貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司，批號20180521)。超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號103018190830)；膜蛋白提取試劑盒(美國賽默飛公司，批號UC279290)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，批號20190215)；OCT1抗體(批號GR3239193-1)、OATP1B1抗體(批號GR3191515-16)、MRP1抗體(批號GR3219564-3)、MRP2抗體(批號GR3269764-1)、BCRP/ABCG2抗體(批號GR3229567-3)、P-gp抗體(批號GR3219236-1)(英國Abcam公司)；GAPDH抗體(批號TH270579)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(批號TB260069)、辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠IgG(批號TC262979)(美國Invitrogen公司)。

1.3 儀器 PowerPacTMBasic電泳儀、Trans-Blot? TurboTMSystem蛋白快速轉印儀(美國Bio-Rad公司)；GBOX-Chemi-XL1.4凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 將24只大鼠隨機分為4組，即空白組，骨康膠囊低、中、高劑量組，每組6只，空白組灌胃給予滅菌蒸餾水7 d，每天2次，骨康膠囊用滅菌蒸餾水配成混懸液后灌胃給藥，低、中、高劑量分別為0.43、0.86、1.72 g/(kg·d-1)，連續(xù)7 d，每天2次。

2.2 大鼠肝臟藥物轉運體蛋白表達檢測 各組大鼠給藥7 d后禁食12 h，自由飲水，股動脈放血處死，取肝臟，生理鹽水灌洗，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫さ鞍滋崛≡噭┖刑崛∧さ鞍祝珺CA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳分離，使用半干轉系統(tǒng)，在25 V、1.0 A條件下轉膜30 min，使用5%BSA在4 ℃下封閉12 h，加入GAPDH抗體(1∶5 000)、OCT1抗體(1∶1 000)、OATP1B1抗體(1∶5 000)、MRP1抗體(1∶500)、MRP2抗體(1∶1 000)、BCRP抗體(1∶1 000)、P-gp抗體(1∶1 000)，在4 ℃下孵育10 h，1×TBST洗膜5次，加入相應的二抗(1∶2 000)，于室溫下孵育1.5 h，1×TBST洗膜5次，加入化學發(fā)光顯影液顯影，使用Quantity one軟件進行條帶灰度值分析，計算目的蛋白/內參蛋白灰度值。

3 結果

3.1 骨康膠囊對大鼠肝臟OCT1、OATP1B1蛋白表達的影響 骨康膠囊低、中劑量組大鼠OCT1蛋白表達較空白組升高(P<0.01)，高劑量組無明顯變化(P>0.05)，各劑量組大鼠OATP1B1蛋白表達均較空白組降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見圖1、表1。

表1 骨康膠囊對大鼠肝臟OCT1、OATP1B1蛋白表達的影響

注：A為空白組，B為骨康膠囊低劑量組，C為骨康膠囊中劑量組，D為骨康膠囊高劑量組。

3.2 骨康膠囊對大鼠肝臟MRP1、MRP2蛋白表達的影響 骨康膠囊低劑量組大鼠MRP1蛋白表達較空白組降低(P<0.05)，中、高劑量組升高(P<0.05，P<0.01)，低、高劑量組大鼠MRP2蛋白表達與空白組比較無明顯變化(P>0.05)，中劑量組升高(P<0.01)，見圖2、表2。

注：A為空白組，B為骨康膠囊低劑量組，C為骨康膠囊中劑量組，D為骨康膠囊高劑量組。

表2 骨康膠囊對大鼠肝臟MRP1、MRP2蛋白表達的影響

3.3 骨康膠囊對大鼠肝臟BCRP、P-gp蛋白表達的影響 骨康膠囊各劑量組大鼠BCRP、P-gp蛋白表達均較空白組降低(P<0.01)，見圖3、表3。

注：A為空白組，B為骨康膠囊低劑量組，C為骨康膠囊中劑量組，D為骨康膠囊高劑量組。

表3 骨康膠囊對大鼠肝臟BCRP、P-gp蛋白表達的影響

4 討論

肝臟藥物轉運體參與藥物的吸收、分布、代謝、排泄，其活性的變化可引起生理疾病及藥物相互作用[12]，影響臨床用藥的安全性和有效性[13]。例如，OCT1介導了許多內源性物質和藥物從血液進入肝臟進行生物轉化[14]。利福平可增加OCT1表達，二甲雙胍與其聯(lián)用后可增強二甲雙胍的降血糖作用[15]。OATP1B1參與肝臟從血液中攝取、清除外源性物質，參與非結合型膽紅素及許多臨床藥物的轉運，如利福平、氟伐他汀、甲氨蝶呤等[16-17]。MRP1、MRP2、P-gp和BCRP可以將內源或者外源物泵出胞外[16,18-22]。研究表明多柔比星與MRP1的表達抑制劑聯(lián)用后，可增強其抗結腸癌療效[23]。川芎的活性成分四甲基吡嗪以及黃連解毒湯等中藥制劑均可通過調節(jié)MRP2的表達而起到利膽、改善膽汁淤積病癥的作用[24]。β-淀粉樣蛋白以P-gp為跨膜載體，通過血腦屏障進入血液中[25]。BCRP可介導化療耐藥、內分泌治療耐藥、分子靶向藥物的耐藥等，轉運鹽酸米托蒽醌、柔紅霉素、阿霉素、拓撲西康、依立替康等抗腫瘤藥物[26-27]。

Western blot結果表明，不同劑量骨康膠囊對大鼠肝臟藥物轉運體的影響不同。高劑量骨康膠囊不影響大鼠OCT1蛋白表達，低、中劑量骨康膠囊升高大鼠OCT1蛋白表達，從而增加機體對OCT1底物的吸收；低、中、高劑量骨康膠囊均抑制大鼠OATP1B1蛋白表達，可能會降低機體對OATP1B1底物的吸收；不同劑量骨康膠囊對MRP1的影響有所差異：低劑量骨康膠囊抑制大鼠MRP1蛋白表達，中、高劑量骨康膠囊升高大鼠MRP1蛋白表達；低、高劑量骨康膠囊不影響大鼠MRP2蛋白表達，中劑量骨康膠囊升高大鼠MRP2蛋白表達；低、中、高劑量骨康膠囊均抑制大鼠BCRP、P-gp蛋白表達，可能會減少聯(lián)用藥物的外排，增加其生物利用度。

綜上所述，骨康膠囊可劑量依賴性地改變大鼠肝臟藥物轉運體OATP1B1蛋白表達，非劑量依賴性地改變大鼠肝臟藥物轉運體OCT1、MRP1、MRP2、BCRP和P-gp蛋白表達。這一結果提示當骨康膠囊與相關藥物尤其是一些治療窗較窄的藥物聯(lián)合使用時，可能會發(fā)生轉運體介導的藥物相互作用，影響藥物的吸收、分布等。與藥物轉運體OATP1B1相關藥物聯(lián)合使用時，可通過給藥劑量預測由轉運體介導的藥物相互作用，但與藥物轉運體OCT1、MRP1、MRP2、BCRP和P-gp相關藥物聯(lián)合使用，較難通過給藥劑量預測由轉運體介導的藥物相互作用。當然，由于動物和人在轉運體表達調控上的差異，該結論需要進一步臨床研究來確證。