化濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜的保護作用

婁瑩瑩， 李佃貴， 霍永利， 賈 寧， 徐偉超， 王亞敏， 李 燕

(1.河北省中醫院脾胃病三科，河北 石家莊 050017；2.唐山市血液中心，河北 唐山 063000；3.河北滄州中西醫結合醫院，河北 滄州 061012；4.河北中醫學院研究生學院，河北 石家莊 050091)

潰瘍性結腸炎屬于炎癥性腸病，是一種原因、發病機制不完全明確的慢性非特異性腸道疾病。本病反復發作，纏綿難愈，已經成為公認的世界難題。隨著我國疾病譜的變化，我國潰瘍性結腸炎的發病率逐年上升，且成為結腸腫瘤的重要危險因素[1]。越來越多的研究表明，結腸上皮細胞的異常凋亡可能進一步影響腸黏膜的屏障功能，腸黏膜被破壞或功能喪失，從而導致潰瘍性結腸炎發生[2-3]。因此抑制結腸上皮細胞的過度凋亡，使增殖與凋亡的動態平衡，形成堅固的黏膜保護屏障，是臨床治療潰瘍性結腸炎的有效途徑。國醫大師李佃貴教授提出潰瘍性結腸炎濁毒致病論，并以化濁解毒法為基本治療大法，形成化濁解毒有效方劑，前期研究表明，該法可調節Th1/Th2平衡，發揮抗炎作用。本實驗從細胞凋亡角度驗證化濁解毒法對潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜的保護作用，揭示其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 化濁解毒方由白頭翁15 g、藿香12 g、黃連12 g、茵陳15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮12 g、當歸12 g、芍藥20 g、茯苓15 g、白術 6 g、廣木香9 g、秦皮15 g、地榆12 g、兒茶6 g、苦參9 g、仙鶴草15 g組成，購于河北省中醫院，藥材煎制并濃縮至所需濃度備用，在4 ℃下保存，低、高劑量分別相當于成人用量(3.33 g/kg)的6.25、12.5倍，按20.8、41.6 g/kg給藥。美沙拉嗪腸溶片(250 mg/片，黑龍江葵花藥業股份有限公司)研成細粉，溶于蒸餾水，配制成0.3 g/mL溶液。

1.2 動物 清潔級雄性Wistar大鼠50只，體質量(220±20)g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(冀)2018-008，動物合格證編號1808139。

1.3 試劑 三硝基苯磺酸(美國Simga公司)；兔抗大鼠Bax單克隆抗體(批號bs-0127R)、caspase-9單克隆抗體(批號bs-0049R)、羊抗兔SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒，均購于北京博奧森生物技術有限公司。

1.4 儀器 Olympus光學顯微鏡(日本Olympus公司)；離心機TDL-5-A(上海安亭科學儀器有限公司)；電動玻璃勻漿機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；電熱恒溫水箱600型(天津泰斯特儀器有限公司)；全自動洗板機(美國伯騰儀器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 分組 采用隨機數字表將50只Wistar大鼠分成5組，每組10只，分別為正常對照組、模型組、美沙拉嗪組及化濁解毒方高、低劑量組。

1.5.2 建模 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法[4]，將5%TNBS與50%乙醇等體積比例混合，配置成含TNBS 25 mg/mL的混合液，作為造模劑。大鼠禁食24 h后乙醚麻醉，石蠟油將直徑2 mm的硅膠管潤滑，插入倒置大鼠腸道約7～8 cm，正常對照組大鼠給予生理鹽水約0.8 mL，造模大鼠給予造模劑，劑量100 mg/kg(即4 mL/kg)，垂直倒置大鼠約30 s，造模完畢恢復正常進食飲水。造模后第2天，模型組、美沙拉嗪組、化濁解毒方高劑量組大鼠各死亡1只。隨機抽取造模大鼠2只，斷頭處死，發現結腸組織出現不同程度的充血水腫，有糜爛以及潰瘍形成，提示本次實驗造模成功[5]。

1.5.3 給藥 正常對照組、模型組大鼠給予10 mL/kg生理鹽水，每天1次，連續14 d；化濁解毒方高、低劑量組給藥劑量分別為41.6、20.8 g/kg，按照10 mL/kg劑量給藥，每天1次，連續14 d；美沙拉嗪組給藥劑量0.3 g/kg，連續14 d。

1.5.4 指標測定

1.5.4.1 疾病活動指數(DAI)評分 造模之日起，每天觀察大鼠精神、毛發、體質量、糞便、飲食情況，并詳細記錄，參照Murano等[6]制定的DAI評分標準進行評分。具體公式為DAI=(體質量下降分數+大便性狀分數+便血分數)/3。

1.5.4.2 組織病理學變化 給藥后所有大鼠斷頭處死，在嚴格無菌條件下取出結腸組織，固定24 h后制作石蠟切片，HE染色，在顯微鏡下觀察各組大鼠結腸組織的情況。

1.5.4.3 結腸黏膜Bax、caspase-9蛋白表達 大鼠結腸組織切塊，4%多聚甲醛固定，包埋切片，免疫組化檢測Bax、caspase-9表達[7]，石蠟切片，脫蠟脫水，3% H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，共2次，5%～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，滴加一抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜，5 min PBS 沖洗3次，二抗37 ℃孵育10～30 min，滴加適量辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育10～30 min，顯色劑顯色3～15 min，沖洗、復染、脫水、透明、封片后在顯微鏡下觀察。采用數碼顯微鏡和圖像采集系統觀察并照相，光鏡下陽性反應為黃到棕黃色顆粒, 主要定位于胞漿, 亦可見于胞膜和核膜，應用Image pro-Plus 6.0圖像分析軟件測定其積分光密度。

2 結果

2.1 大鼠DAI評分 與模型組比較，各藥物治療組DAI評分均降低(P<0.05)；化濁解毒方高劑量組DAI評分比低劑量組低(P<0.05)；化濁解毒方高劑量組DAI評分與美沙拉嗪組比較，無明顯變化(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠DAI評分

2.2 大鼠結腸病理學變化 正常對照組大鼠結腸黏膜光滑，腺體結構完整，排列規則，無充血、水腫、糜爛或潰瘍；模型組大鼠結腸黏膜充血、水腫明顯，可見多發糜爛、潰瘍灶形成，鏡下腺體排列不規則、紊亂，杯狀細胞減少，周圍大量炎性細胞浸潤；化濁解毒方高劑量組、美沙拉嗪組大鼠結腸黏膜基本光滑，充血、水腫減輕，潰瘍較少并可見已愈合的潰瘍面，腺體結構基本完整，炎性細胞也明顯減少；化濁解毒方低劑量組大鼠結腸黏膜表面欠光滑，結腸組織輕度充血、水腫，可見少量糜爛、潰瘍，腺體結構少量被破壞，部分邊緣覆少量新生腺體，見圖1。

圖1 各組小鼠結腸組織病理變化(×100)

2.3 對大鼠結腸上皮細胞Bax蛋白表達的影響 正常對照組大鼠結腸上皮細胞Bax呈弱陽性表達；與正常對照組比較，模型組大鼠結腸上皮細胞Bax蛋白的表達升高(P<0.05)；與模型組比較，化濁解毒方高低劑量組、美沙拉嗪組Bax蛋白表達降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠結腸上皮細胞Bax蛋白表達

2.4 對大鼠結腸上皮細胞caspase 9表達的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠結腸上皮細胞的caspase 9表達升高(P<0.05)；與模型組比較，化濁解毒方組、美沙拉嗪組caspase 9表達降低(P<0.05)，其中高劑量組低于低劑量組(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠結腸上皮細胞caspase 9表達

3 討論

潰瘍性結腸炎以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現。潰瘍性結腸炎的發病機制目前尚未完全明確，認為是感染、精神、遺傳、免疫等多種因素綜合作用的結果[8]。同時研究表明，潰瘍性結腸炎的發生與上皮細胞破壞和凋亡有著密切關系[9-11]。細胞凋亡是一種重要的生物學過程，是在基因調控下所發生的一系列細胞主動死亡過程[12]。當潰瘍性結腸炎發生時，結腸上皮細胞增殖與凋亡平衡失調、凋亡過度，結腸上皮細胞和炎癥細胞的失去協調作用，進而破壞上皮細胞屏障，引起物理性、化學性損傷，進而形成潰瘍，如果上皮細胞脫落過快，潰瘍將難以愈合[11]。抑制結腸上皮細胞的過度凋亡，促進受損黏膜的修復、愈合是潰瘍性結腸炎治療思路。Bax基因是人體最主要的凋亡基因，具有促進細胞凋亡的作用。Bax促進細胞色素C釋放到胞質，進而與Apaf-1及激活的caspase-9形成凋亡小體，從而激活caspase-3及后續線粒體凋亡途徑，導致細胞凋亡[13]。研究顯示caspase-9在細胞過度表達，凋亡率明顯增高[14]。

對于潰瘍性結腸炎病機認識，中醫藥治療中提出“濁毒致病論”，認為是因飲食內傷、情志不舒，導致肝胃不和、胃氣失和、通降失職、清陽不升、濁邪內停，日久則脾失健運，水濕不化，濕濁中阻，郁滯不通，蘊久化熱，熱壅血瘀而成毒，濁毒聚于腸腑，氣血瘀滯，血敗肉腐，傷及腸壁血絡，則會出現黏液膿血便、腹瀉、腹痛等[15]。潰瘍性結腸炎病機在于濁毒內蘊。化濁解毒方由白頭翁湯、香連丸、當歸芍藥散等加減組合而成。結果顯示，化濁解毒方可降低UC大鼠DAI評分，改善結腸組織病理形態。與空白組比較，模型組大鼠Bax、caspase 9蛋白的表達增高，經治療后各藥物治療組Bax、caspase 9蛋白的表達均降低，其中化濁解毒方降低最為明顯，與美沙拉嗪組效果相當。提示化濁解毒方治療潰瘍性結腸炎的作用機理可能是下調Bax、caspase 9蛋白的表達，抑制潰瘍性結腸炎大鼠結腸上皮細胞的過度凋亡，促進損傷結腸黏膜的修復，進一步促進潰瘍面的愈合。因此，化濁解毒法治療潰瘍性結腸炎具有廣闊的應用前景，應進一步挖掘其維持腸黏膜屏障穩態的深層作用機制。