基于網絡藥理學研究白頭翁湯治療結直腸癌的作用機制

伍謹林， 楊 柱,2， 龍奉璽,2， 吳文宇， 姚 琦， 楊 兵， 劉 薰， 唐東昕,2*

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴州省中醫腫瘤傳承與科技創新人才基地，貴州 貴陽 550002；3.貴州中醫藥大學附屬第一醫院，貴州 貴陽 550002)

結直腸癌作為最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在近年來呈現上升趨勢，在2018年癌癥新發病率和死亡率中，結直腸癌排在第三位[1]。治療上主要有手術、放化療、靶向治療及生物免疫治療等手段，但副作用明顯。中醫藥作為祖國醫學重要的組成部分，在聯合手術、放化療治療時，具有增效減毒，改善免疫力，提高生活質量及經濟效益比的優勢，對結直腸癌的輔助治療日益受到重視[2]。

在中醫學中，結直腸癌歸為“腸積”“鎖肛痔”等范疇，外感邪毒或飲食失調，脾胃濕熱蘊結，下注腸道，灼血為瘀，熱盛成毒，日久發為腸癌，可見腹痛腹脹，里急后重，下利膿血粘液便等證，可予以白頭翁湯進行治療。白頭翁湯主要由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味中藥組成，首見于張仲景《傷寒論》有“熱利下重者，白頭翁湯主之”[3-5]。方中白頭翁清熱涼血解毒；黃連瀉火解毒，黃柏清利下焦濕熱；秦皮清熱解毒兼具收澀作用。

白頭翁湯藥物化學成分較為復雜，現代藥理研究顯示[6]其具有抑菌、殺菌、抗炎、抗氧化損傷、抗腫瘤、調節免疫、保護胃腸道黏膜、改善心血管功能等作用。白頭翁湯可以通過阻止腫瘤細胞周期、誘導分化及凋亡、抑制細胞增殖等[7-9]機制治療結直腸癌，緩解患者臨床癥狀[10]。基因研究組學證實[11]白頭翁湯可影響直腸癌患者細胞內一系列基因的表達，它們主要富集在STAT、MAPK等信號傳導通路，可能與其抗腫瘤效果相關。但對白頭翁湯治療結直腸癌的作用機制尚不明確。

網絡藥理學作為系統生物學及多向藥理學的新型結合體，尤其適用于中藥這類具有明確功效，但藥理機制不甚清楚，并需要進行深入挖掘的藥物分析。本文通過網絡藥理學分析白頭翁湯治療結直腸癌的藥物成分、靶點、分子機制、信號通路等，構建相關網絡進行剖析，為深入探討白頭翁湯治療結直腸癌的作用機制提供科學、有效的客觀依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫及軟件 TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/)、Pubchem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Genecards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(http://omim.org/)、Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)、STRING數據庫(https://string-db.org/)、DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)、Cytoscape 3.7.1軟件、R語言軟件。

1.2 有效成分篩選 應用TCMSP數據庫找到白頭翁湯4種藥材所含的266種成分，其中白頭翁57種，黃柏140種，黃連48種，秦皮21種。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出活性較高的成分共48種，見表1。

表1 白頭翁湯活性成分

1.3 治療結直腸癌潛在效應靶點預測 利用TCMSP數據庫中的Related Targets、Targets Infomation對有效成分進行潛在靶點預測，將對應的潛在靶點英文全名通過perl軟件與從Uniprot數據庫編輯所得的uniprot.tsv文件相關聯，通過映射找到潛在靶點所對應的官方名稱(offical symbol)，在篩除重復的靶點后共得到181個潛在靶點。

通過GeneCards數據庫和OMIM數據庫中的Gene map網站，輸入結直腸癌的英文名稱“colorectal cancer”，獲取結直腸癌相關疾病靶點，因疾病靶點較多，設置條件為Relevance score≥1對GeneCards數據庫檢索出的結果進行篩選，以增強疾病靶點與結直腸癌的關聯性，將篩選出的結果與Gene map網站結果合并，去除重復靶點，共獲得結直腸癌疾病相關靶點6 574個。

將有效成分相應靶點及結直腸癌疾病靶點相互映射，所得共有靶點即為治療結直腸癌的潛在效應靶點，共153個，對應白頭翁湯中33種活性成分，見表2。

表2 白頭翁湯活性成分對應的靶基因

2 潛在效應基因靶點網絡構建及基因富集分析

2.1 疾病-藥物化學成分-潛在效應靶點網絡關系構建 將活性成分、治療結直腸癌潛在效應靶點等信息導入Cytoscape 3.7.1軟件，制成疾病-藥物化學成分-潛在效應靶點網絡關系圖，發現共有188個節點，包含1個(圓形節點)白頭翁湯、1類(六邊形節點)疾病結直腸癌、33個(菱形節點)活性成分、153個(長方形節點)潛在效應靶點，585條邊代表了白頭翁湯、活性成分、潛在效應靶點及結直腸癌對應關系，見圖1。應用Cytoscape-Tool-Network Analyzer分析節點的度值及介數值，計算出平均度值為13.09，平均介數值為0.011 7，槲皮素(degree為126)、異鼠李素(degree為22)、β-谷甾醇(degree為22)排在活性成分前三位，另外黃連素雖然度值較小(degree為11)，但具有較強的抗腫瘤作用[12-14]，故考慮四者作為白頭翁湯治療結直腸癌的主要成分。

圖1 疾病-藥物化學成分-潛在效應靶點網絡關系圖

2.2 潛在效應靶點PPI網絡構建 利用STRING數據庫，將所得潛在效應靶點互作信息導入Cytoscape 3.7.1軟件制作PPI互作網絡圖，共153個靶點，2 527條邊，節點大小及顏色變化反應節點度值情況，見圖2。網絡中平均度值為33，平均介數值為0.005 9，網絡中有58個靶點超過度值均值，AKT1、IL6、VEGFA、MAPK1、JUN、EGFR、MYC、ERBB2、STAT1等靶點為白頭翁湯治療結直腸癌的關鍵潛在效應靶點，與基因研究組學報告的基因差異表達結果[11]一致。

圖2 潛在效應靶點PPI網絡關系圖

2.3 GO功能富集分析 通過DAVID 6.8數據庫對潛在效應靶點進行GO分析，共得到1 166個條目，根據錯誤發現率(false discovery rate，FDR)<0.05標準篩選后得到318個，其中與生物過程相關條目291個，涉及細胞增殖、凋亡、生物合成、信號傳導、能量代謝、激素水平、RNA及DNA代謝、免疫調節、機體發育等；與分子功能相關條目15個，涉及核受體活性、類固醇激素受體活性、胺受體活性、細胞因子活性、轉錄因子活性、脂質結合、酶結合等；與細胞構成相關條目12個，涉及細胞質、細胞膜、囊泡、微粒、細胞外區域等，將GO分析中結果靠前的條目進行柱狀圖分析，并對生物過程、細胞構成、分子功能排名前十的結果進行可視化分析，見圖3。

圖3 GO功能富集分析

2.4 KEGG通路富集及治療機制分析

2.4.1 KEGG通路富集分析 應用DAVID 6.8數據庫對潛在效應靶點進行KEGG通路富集分析，在PPI網絡中共有153個相關靶點，在通路富集分析時利用了81.6%，即124個，共找到相關信號通路56條，依據FDR值<0.05進行篩選，得到18條相關通路，包括癌癥傳導途徑、膀胱癌通路、前列腺癌通路、非小細胞肺癌通路、胰腺癌通路、小細胞肺癌通路、結直腸癌通路、慢性粒細胞白血病、膠質瘤通路、子宮內膜癌通路、Toll樣受體信號通路、ErbB信號通路、T細胞受體信號通路、FAK信號通路、VEGF信號通路、p53信號通路、細胞凋亡通路、NOD樣受體信號通路，見圖4。排除8條惡性腫瘤通路，剩余10條通路可能是治療結直腸癌的主要途徑，即結直腸癌通路、癌癥傳導通路、Toll樣受體信號通路、ErbB信號通路、T細胞受體信號通路、FAK信號通路、VEGF信號通路、p53信號通路、細胞凋亡通路、NOD樣受體信號通路。

圖4 KEGG通路富集分析

2.4.2 白頭翁湯治療結直腸癌機制分析 將10條通路與其對應的70個靶點構建Cytoscape網絡圖，根據度值調整節點大小，見圖5，可知靶點間度值的平均值為2.37，AKT1、MAPK1、JUN、RAF1、GSK3B、RELA、CHUK、CASP8、CASP9、NFKBIA、MAPK14、BAX、CCND1、PRKCB、PRKCA、EGFR、BCL2、CASP3、FOS、IL1β、VEGFA、CDKN1A、IL6、MYC、EGF、ERBB2的度值超過平均值，與STRING數據庫分析靶點間PPI互作關系得出的結論基本一致。白頭翁湯治療結直腸癌可能通過4個途徑實現，即腫瘤代謝途徑、炎癥途徑、細胞凋亡途徑、血管生成途徑，其中結直腸癌通路、癌癥傳導通路與腫瘤代謝途徑關系密切，Toll樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、FAK信號通路、NOD樣受體信號通路與炎癥途徑相關，p53信號通路、細胞凋亡通路、FAK信號通路可與細胞凋亡途徑相連接，VEGF信號通路、ErbB信號通路、FAK信號通路與血管生成途徑相關。在核心靶點中，AKT1、IL1β、Bax、VEGFA在Cytoscape網絡圖中的度值均超過平均值。PI3K/Akt信號通路是調節腫瘤細胞生長、轉移的重要信號通路，其激活不僅誘導細胞凋亡，并且介導糖酵解的發生，可促進大腸癌細胞的異常生長、增殖、浸潤及轉移[15]，Akt1靶點與白頭翁湯治療結直腸癌的腫瘤代謝途徑、細胞凋亡途徑相關性較大；Toll樣受體信號通路激活來源于胞漿Toll/IL-1的結構域，可能誘發炎癥，促進結直腸癌細胞增殖、免疫逃逸、浸潤及轉移[16]，IL-1β與白頭翁湯治療結直腸癌的炎癥途徑相關性較大；Bax基因是人體最主要的凋亡基因，編碼的Bax蛋白可與Bcl-2形成異二聚體，Bax/Bcl-2比例與結直腸癌的細胞凋亡調控相關[17]，與白頭翁湯治療結直腸癌的細胞凋亡途徑相關性較大；VEGFA是作用最強的促血管生長因子之一，能特異性刺激腫瘤血管內皮細胞增殖與血管生成[18]，在結直腸癌中可對微血管形成起誘導作用，Wnt/β-catenin信號通路下游的T細胞因子可激活其表達，促進腸癌細胞的侵襲及轉移[19]，與白頭翁湯治療結直腸癌的血管新生途徑相關性大。

圖5 白頭翁湯治療結直腸癌信號通路-靶點網絡圖

3 結果驗證

3.1 材料

3.1.1 細胞 人結腸癌細胞株SW480(上海奧陸生物科技有限公司,編號20180619-446W)，常規消化傳代保存處理。

3.1.2 動物 BALB/c雄性3周齡裸鼠，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0002。

3.1.3 試劑與藥物 白頭翁湯組方藥材白頭翁15 g、黃連 6 g、黃柏 12 g、秦皮12 g(華潤三九醫藥股份有限公司，批號1706002w)。1640培養基(美國Gibco公司，批號8119346)；DMSO試劑(北京索萊寶科技有限公司，批號1213C0214)；PBS試劑(批號0043019)、10%FBS(批號1928700)、青鏈霉素(批號1914361)，北京沃比森科技有限公司；RIPA 裂解液(批號100117171213)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(批號010317170103)、HE染色試劑盒(貨號C0105)(上海碧云天生物技術有限公司)；Rabbit anti-Akt1 antibody(北京博奧森生物有限公司，批號bs-0115R)；Rabbit anti-VEGFA antibody(武漢三鷹生物技術有限公司，批號19003-1-AP)、Rabbit anti-IL-1β antibody(英國Abcam公司，批號ab9722)；Bax Rabbit PolyAb(北京索萊寶科技有限公司，批號50599-2-lg)；Rabbit anti-GAPDH antibody(杭州賢至生物科技有限公司，批號AB-P-R001)。

3.1.4 儀器 超聲波細胞破碎機(美國Cole Partner公司)；LB943多功能酶標儀(德國Berthold Technologies公司)；低溫高速離心機(北京泰澤瑞達科技有限公司)；TB-215D電子天平(美國丹佛公司)；SIM-F140AY65-PC型雪花制冰機(日本松下公司)；MLTRAGEMK2超純水系統(英國ELGA公司)；垂直電泳儀、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；脫色搖床(北京北方同正生物技術發展有限公司)；SW-CJ-2陽型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；RM 2235型組織切片機(德國Leica公司)；YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(孝感市亞光醫用電子技術有限公司)；YT-7F型攤烤片機(湖南亞光科技有限公司)。

3.2 方法

3.2.1 分組、造模及給藥 將BALB/c裸鼠適應性喂養5 d后隨機分為空白對照組、模型對照組、白頭翁湯高劑量組、白頭翁湯低劑量組，每組6只，將對數生長的人結腸癌細胞SW480按照8×107/mL密度皮下注射(空白對照組除外)，注射量0.2 mL，觀察成瘤情況，注射7 d后發現全部成瘤，注射14 d后對裸鼠進行灌胃，白頭翁湯高、低劑量組給藥量分別為6.82、3.41 g/kg[20]，溶于0.2 mL生理鹽水進行灌胃，每天1次，連續14 d，空白對照組、模型對照組予以等量生理鹽水灌胃。

3.2.2 指標檢測

3.2.2.1 轉移瘤體積 灌胃14 d后，對各組BALB/c裸鼠右側腋下正常組織及轉移瘤進行取材，計算瘤體積，公式為瘤體積=ab2/2，其中a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑。

3.2.2.2 腋下正常組織及瘤體HE染色 空白對照組選取1只裸鼠右側腋下正常組織，其余3組各選取1只裸鼠右側腋下瘤體，進行HE染色。將組織浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，70%乙醇組織脫水24 h，80%乙醇組織脫水24 h，95%乙醇組織脫水12 h，無水乙醇脫水2 h，浸蠟3 h后包埋組織，待其充分冷卻后取出石蠟塊，并進行修塊等處理，連續切片(厚度4 μm)，在30%乙醇浸沾后放入40 ℃水浴鍋中充分展開，用載玻片小心將組織緊貼于玻片上，烤片機上烘烤3 h，置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各脫蠟10 min，浸入無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5 min，依次放入95%乙醇、80%乙醇各3 min，蒸餾水沖洗切片2 min，放入蘇木素中染核10 min，自來水沖洗15 min，蒸餾水清洗20 s，0.5%伊紅染色5 s，蒸餾水洗凈，80%乙醇浸泡2 min，95%乙醇浸泡3 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ浸泡各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浸泡各5 min，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察。

3.2.2.3 Western blot檢測Akt1、IL-1β、Bax、VEGFA蛋白表達 稱取組織適量，通過RIPA裂解液提取組織總蛋白，BCA工作液測定待測樣品蛋白濃度，在煮沸變性、低溫離心后取10 μg上清液上樣，經蛋白垂直電泳、轉膜、封閉、孵育一抗及二抗等步驟后顯色，在凝膠成像系統中成像拍照，測定各蛋白條帶的灰度值。

3.3 結果

3.3.1 轉移瘤體積 與模型對照組比較，白頭翁湯組轉移瘤體積有不同程度的減小，以高劑量組更明顯(P<0.05)，見表3。

表3 各組裸鼠轉移瘤體積

3.3.2 HE染色 空白對照組局部可見正常淋巴細胞以及結締組織，未見明顯結構、細胞形態改變及腫瘤細胞浸潤；模型對照組鏡下可見周圍腫瘤細胞浸潤明顯，出現病理性核分裂，有腺樣結構形成；白頭翁湯高劑量組鏡下見周圍殘存的淋巴細胞，局部仍可見異常增生細胞；白頭翁湯低劑量組見細胞異型明顯，核染色質致密，伴見周圍區域有局部壞死，見圖6。

圖6 各組裸鼠病理組織HE染色(×40，100 μm)

3.3.3 Akt1、IL-1β、Bax、VEGFA蛋白表達 與模型對照組比較，白頭翁湯高劑量組Akt1、IL-1β、VEGFA蛋白表達降低(P<0.05)；與空白對照組比較，模型對照組、白頭翁湯組Bax表達降低，但模型對照組與白頭翁湯高劑量組無明顯差異(P>0.05)。見圖7。

注：與模型對照組比較，*P<0.05；與空白對照組比較，#P<0.05。

4 討論

本研究根據網絡藥理學方法預測，結合動物實驗驗證，初步解析、挖掘白頭翁湯治療結直腸癌的作用機制。GO功能富集分析顯示，核堿基、核苷、苷酸和核酸代謝過程的正調節，細胞周期的調節等生物過程與腫瘤物質能量調控相關；炎癥反應、對糖皮質激素刺激的反應等涉及炎癥的調控；細胞凋亡的調節、程序性細胞死亡的調節、細胞增殖的調節等過程與腫瘤細胞的凋亡、增殖相關；血管發育、脈管系統發育等影響腫瘤新生血管形成。以上生物過程及細胞調節涉及復雜的分子功能，一方面說明結直腸癌發病機制的復雜、易變性，另一方面，也體現中藥治療中多成分、多靶點特性，說明白頭翁湯能夠從不同角度、多管齊下對干預結直腸癌的發生、侵襲、轉移過程。

KEGG信號通路富集分析顯示，白頭翁湯治療結直腸癌的信號通路主要與腫瘤代謝途徑、血管生成途徑、細胞凋亡途徑及炎癥途徑相關，具體涉及到以上10條與結直腸癌發生發展相關性較大的信號通路。Akt1作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在腫瘤細胞的能量代謝及凋亡中起關鍵作用，在結直腸癌中高表達[21]。PI3K/Akt通路是一條經典的腫瘤細胞信號傳導途徑，研究發現通過直接使人結腸癌細胞系中的Akt1基因失活，對細胞生長影響較小，但當生長因子受限并影響實驗小鼠腫瘤轉移時，敲除Akt1將導致腫瘤細胞增殖能力顯著下降[22]。IL-1β是炎性因子IL-1的亞型之一，屬于多效性促炎癥細胞因子類，在惡性腫瘤的免疫微環境中起重要作用，主要由巨噬細胞分泌，作為Toll信號通路的上游細胞因子，可激活Toll信號通路促進固有免疫和適應性免疫應答，在結直腸癌的發生發展中發揮重要作用[23]，也可通過誘導如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、VEGF、炎癥趨化因子等多種腫瘤轉移細胞因子表達而促進結腸癌進展和轉移[24]。Bax是Bcl-2家族成員中含有多BH結構域的多功能蛋白，在促進腫瘤細胞凋亡過程中發揮著重要作用，Bcl-2/Bax的比值可以反映細胞是否發生凋亡，當其比值上升，Bcl-2與Bax可形成異源二聚體抑制腫瘤細胞凋亡發生[25]。VEGF信號通路對腫瘤在侵襲轉移方面起誘導作用，與結直腸腫瘤血管新生、浸潤生長有關鍵作用[26]，目前臨床廣泛使用的靶向藥物貝伐單抗，能夠與VEGFA結合，阻止腫瘤新生血管的形成，起到較為明顯的抗腫瘤作用[27]。

在4個主要化學成分中，槲皮素是一種具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤特性的植物類黃酮，其作用于結腸癌LOVO細胞可引起Bax、p53表達上調，抑制Bcl-2基因誘導腫瘤細胞凋亡[28],作用于HT-29細胞也可導致抑癌基因p53表達增強引起細胞凋亡,抑制腸癌細胞的增殖[29]。異鼠李素具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫等多種生物活性，發現其可以通過抑制表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)磷酸化、降低VEGF活性、減少Bcl-2蛋白水平進而活化caspase-3, 實現誘導細胞凋亡并抑制細胞增殖的作用[30]。β-谷甾醇是白頭翁的主要化學成分，研究發現[31]β-谷甾醇能夠清除活性氧誘導癌細胞凋亡，并抑制β-catenin及PCNA抗原表達的腫瘤細胞生長。黃連素是黃連抗腫瘤的主要化學成分，具有較強的體內外抗腫瘤活性[32-33]，并能誘導結直腸癌細胞HCT-15，HT29等的凋亡，抑制腫瘤增殖[34-35]。這與本研究中分析結果基本一致，考慮白頭翁湯治療結直腸癌主要通過腫瘤代謝途徑、血管生成途徑、細胞凋亡途徑及炎癥途徑等多途徑實現。

在實驗驗證中，部分指標與網絡藥理學研究預測結果不相符，在白頭翁湯治療小鼠右側腋下結直腸癌轉移瘤的Western blot檢測中，與模型對照組比較，對Bax蛋白表達水平影響不明顯，導致實驗結果與網絡藥理學預測分析存在一定差異。推測實驗結果未能驗證預測的原因有以下幾點，(1)動物實驗樣本量有限，實驗結果存在一定偏倚，需進一步加大樣本量進行驗證；(2)在網絡藥理學分析過程中對靶點及通路的預測及相關性不夠精準，可能與檢索數據庫不夠全面、篩選標準差異性等因素相關；(3)對于白頭翁湯中藥物含有的有效化學成分未定量分析，導致在治療腫瘤過程中療效產生差異；(4)在實驗及檢測過程中，操作和統計造成的誤差過大。

綜上，白頭翁湯可通過多途徑、多靶點治療結直腸癌，增加了白頭翁湯治療結直腸癌藥理作用的新認識，也為相關研究提供新方向及新思路的理論及實踐參考。