基于偏最小二乘回歸法的黑果菝葜乙酸乙酯部位抗腫瘤譜效關(guān)系

王春艷， 侯益民， 李漢偉， 蘇秀紅,2*， 董誠明,2， 陳隨清,2

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發(fā)河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046)

近年來，腫瘤的發(fā)病率不斷攀升，惡性腫瘤嚴重影響人類的身體健康甚至危及生命，而治療腫瘤的基本手段主要依賴于放療和化療，但放化療藥的不良反應(yīng)較大，故從天然植物中尋找和開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物，具有廣闊的研究前景[1]。

黑果菝葜為百合科菝葜屬攀援灌木，收載于《中華本草》《南陽中草藥名典》《秦嶺植物志》《涉縣中藥志》等著作。以根莖入藥，為“金剛藤”基源之一，具有祛風(fēng)、清熱、利濕、解毒等功效，臨床上常用于治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、盆腔炎等疾病[2]。研究表明菝葜屬植物中多含有黃酮類物質(zhì)，有抗腫瘤的活性，且菝葜屬植物中菝葜、土茯苓等對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[3]。有研究表明，臨床復(fù)方菝葜顆粒可較好地治療非小細胞肺癌[4]。張蓮萍[5]認為菝葜乙酸乙酯提取物的抗癌活性高于正丁醇及乙醇提取物；王濤等[6]發(fā)現(xiàn)菝葜的乙酸乙酯提取物質(zhì)可有效抑制肝癌細胞的增殖；吳先闖等[7]比較了菝葜乙醇總提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對3種肝癌細胞的抑制活性，其乙酸乙酯部位對肝癌細胞抑制活性最強。故課題組選用黑果菝葜乙酸乙酯部位進行抗腫瘤篩選，且黑果菝葜作為菝葜屬中一個常用的藥用植物資源可能具有潛在的抗腫瘤研發(fā)價值，但目前對黑果菝葜的研究甚少[8-9]。

中藥是多成分、多靶點綜合作用的復(fù)雜體系，其藥效是多種成分共同作用的結(jié)果，而中藥譜效學(xué)是基于解決中藥活性成分復(fù)雜、藥理作用機制不明等問題的一門學(xué)科，廣泛應(yīng)用于中藥藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，可將化學(xué)成分的變化與藥效指標相結(jié)合，為中藥的質(zhì)量控制和藥效評價提供科學(xué)依據(jù)[10]。目前雖然有研究對黑果菝葜中的成分進行了分離鑒定，但尚未見關(guān)于該藥用植物中各成分與其抗腫瘤活性的研究。因此，本研究通過體外實驗考察了黑果菝葜乙酸乙酯部位對肝癌SMMC-7721細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人胃癌MGC80-3細胞抑制率影響，以確定其抗腫瘤活性部位并建立黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721細胞活性部位的指紋圖譜，在此基礎(chǔ)之上探究黑果菝葜活性部位指紋圖譜特征峰與藥效間的相關(guān)性，以期揭示黑果菝葜抗腫瘤活性的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為黑果菝葜中抗腫瘤活性成分的提取富集及其資源合理開發(fā)和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

Waters e2695-2489型高效液相(美國沃特世公司)；VARIOSKAN LUX型自動酶標儀、Scilentific 371型CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司)；IMS105DU型天平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多集團)；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA FDU-1200型冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司)。

胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號SA190501)，MEM培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號WH0111201911SP)；噻唑藍(MTT，批號725C0511)、DMSO(批號11001G031)、0.25%胰酶(批號2050302)、青霉素-鏈霉素混合液(雙抗)(批號20190712)，以上試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

人肝癌SMMC-7721細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人胃癌MGC80-3細胞購自中國科學(xué)院上海細胞所。黑果菝葜采集信息見表1，由河南中醫(yī)藥大學(xué)蘇秀紅教授鑒定為百合科菝葜屬黑果菝葜Smilaxglauco-chinaWarb.。

表1 樣品信息

2 方法

2.1 色譜條件 以ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～15 min，5%～10% A；15～35 min，10%～15% A；35～55 min，15%～20% A；55～90 min，20%～30% A；90～105 min，30%～33% A)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 稱取白藜蘆醇對照品適量，加甲醇溶解，制備成適當(dāng)質(zhì)量濃度的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取黑果菝葜各產(chǎn)地藥材粉末100 g，加入10倍量70%乙醇回流提取1.5 h，重復(fù)3次，合并濾液，減壓回收乙醇，得到乙醇總提物浸膏，蒸干后加水200 mL，取1/5作乙醇總提取液，剩余4/5提取液乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯部位；減壓回收各部位萃取液，冷凍干燥成粉末，配制備成5 mg/mL溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3 體外抗腫瘤活性實驗MTT法 參考文獻[11-13]，人肝癌SMMC-7721細胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基，人非小細胞肺癌A549細胞和人胃癌MGC80-3細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的SMMC-7721、A549和MGC80-3細胞株，用0.25%胰蛋白酶消化，含10%胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)制成5×104/mL的單細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種100 μL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸出原培養(yǎng)液，設(shè)置對照組(加入等體積不含血清的培養(yǎng)基)和藥物組。藥物組，乙酸乙酯部位，每組藥物設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度(12.5、25、50、75、100 μg/mL)，每個質(zhì)量濃度復(fù)種3個孔，每孔100 μL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，在振蕩器上搖勻15 min，待其結(jié)晶完全溶解后，設(shè)置波長為490 nm，在酶標儀測定OD值。以上實驗均重復(fù)3次，細胞抑制率=[(OD對照組-OD給藥組)/OD對照組]×100%。

2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，以Graphpad Prism 7.0軟件計算各組樣品IC50值。以黑果菝葜指紋圖譜中各共有峰的峰面積為自變量，SMMC-7721腫瘤細胞抑制率為因變量，采用SIMCA-P 13.0軟件對其進行偏最小二乘回歸分析，建立回歸方程。

3 結(jié)果與分析

3.1 黑果菝葜乙酸乙酯部位對SMMC-7721、A549、MGC80-3細胞抑制率的影響 由表2可知，乙酸乙酯部位給藥組在一定質(zhì)量濃度下對SMMC-7721、A549、MGC80-3細胞均具有抑制作用，當(dāng)給藥質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，IC50值分別為19.27 μg/mL、大于100和無法計算。因此，當(dāng)給藥濃度為100 μg/mL時，乙酸乙酯部位對細胞SMMC-7721細胞抑制作用最強，故選擇SMMC-7721細胞株進行以下實驗。

表2 黑果菝葜乙酸乙酯部位對SMMC-7721、A549、MGC80-3細胞株的細胞抑制率影響

3.2 黑果菝葜乙酸乙酯部位HPLC指紋圖譜建立 按“2.2.2”項下方法制備10批樣品的供試品溶液，各吸取10 μL，進行HPLC檢測，文件導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012.130723)”，設(shè)置H3圖譜為參照圖譜，采用多點校正將色譜峰自動匹配，得出10批樣品指紋圖譜，見圖1，確定了17個共有峰，見圖2，以7號峰白藜蘆醇為指標峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，見表3。發(fā)現(xiàn)各共有峰相對保留時間較為一致，RSD均小于2.33%，相對峰面積RSD為67.715%～218.165%，表明不同產(chǎn)地黑果菝葜主要成分的含量具有一定差異性。通過對比各樣品相似度發(fā)現(xiàn)，5批樣品相似度在0.9以上，見表4，4批在0.8以上，駐馬店市西平縣出山鎮(zhèn)月林村(H5)相似度為0.688。

圖1 10批黑果菝葜乙酸乙酯部位樣品HPLC指紋圖譜

圖2 黑果菝葜乙酸乙酯部位樣品共有峰

表3 10批黑果菝葜乙酸乙酯部位樣品共有峰相對峰面積

表4 10批不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位相似度

3.3 不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位對SMMC-7721細胞抑制率的影響 由表5可知，與對照組比較，10批黑果菝葜樣品均有抑制腫瘤的作用(P<0.01)。10批樣品進行組間比較，南陽市西峽縣雙龍鎮(zhèn)十畝地村(H1)與南陽市西峽縣白羽街道土門社區(qū)壽山(H2)無顯著性差異(P>0.05)，駐馬店市西平縣出山鎮(zhèn)月林村(H5)、南陽市淅川縣上集鎮(zhèn)朝陽社區(qū)范蠡公園(H7)和南陽市西峽縣米坪鎮(zhèn)大莊村(H10)無顯著性差異(P>0.05)。南陽市方城縣二郎廟鎮(zhèn)五神廟村(H3)對SMMC-7721細胞抑制效果最好，細胞抑制率為81.115%。

表5 不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位對SMMC-7721細胞抑制率的影響

3.4 黑果菝葜乙酸乙酯部位抗肝癌SMMC-7721譜效關(guān)系分析

3.4.1 偏最小二乘回歸方程的建立 以不同產(chǎn)地黑果菝葜乙酸乙酯部位指紋圖譜各共有峰的峰面積為自變量X，細胞抑制率為因變量Y，導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件，進行偏最小二乘回歸分析，得回歸方程為Y=0.001 4X1+0.001 6X2-0.005 0X3+0.003 7X4+0.002 4X5+0.002 1X6-0.000 3X7+0.000 5X8-0.000 2X9+0.001 1X10+0.000 8X11+0.002 5X12+0.001 5X13-0.000 7X14+0.003 2X15+0.003 0X16+0.000 9X17，偏最小二乘回歸模型回歸系數(shù)見圖3，峰1、2、4、5、6、8、10、11、12、13、15、16、17回歸系數(shù)為正值，其貢獻大小順序為(絕對值)4>15>16>12>5>6>2>13>1>10>17>11>8，其余峰的回歸系數(shù)為負值。

圖3 黑果菝葜抗腫瘤譜效關(guān)系偏最小二乘回歸系數(shù)

3.4.2 變量重要性分析 變量投影重要性(VIP值)分析結(jié)果見圖4，表明S1、S3、S5,S6、S7的VIP值大于1，排序為S7>S1>S6>S3>S5，其中，S1、S5、S6與藥效成正相關(guān)，當(dāng)含量增加時，會明顯提高細胞抑制率；模型診斷參數(shù)R2X=0.934，R2Y=0.987，Q2=0.817，表明該回歸模型具有較強的擬合解釋能力和模型預(yù)測能力。

圖4 各共有峰對黑果菝葜抗腫瘤活性的變量重要性分析

4 討論

本研究前期對色譜柱、流動相的比例、柱溫以及檢測波長等色譜條件進行了探索。比較不同廠家的C18色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)能有效的分離化學(xué)成分，且峰形較好。當(dāng)采用乙腈-水體系時，得到的色譜峰數(shù)量較多且分離度較好。在其他色譜條件相同的情況下，分別設(shè)定柱溫25、30、35、40 ℃，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，各色譜峰的保留時間不斷前移，當(dāng)柱溫為30 ℃時，色譜峰分離效果好。液相色譜檢測波長主要參照白藜蘆醇的范圍，并參考文獻知其為多酚類化合物，波長330～350 nm[14]，由此并對樣品進行190～400 nm全波長掃描，考察了在238、290、303、330 nm波長處的色譜峰，圖譜在330 nm處出峰較多，且峰形較好。

文一惠等[15]發(fā)現(xiàn)金剛藤可抑制SMMC-7721 細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡等，但是由于俗名為“金剛藤”的原植物達14種之多，甚至為不同的科屬，且未明確指出所研究的金剛藤的基源。但從報道推測應(yīng)為百合科菝葜屬植物，這一結(jié)果表明菝葜屬植物在抗肝癌方面可能有著一定療效。本研究發(fā)現(xiàn)南陽市方城縣二郎廟鎮(zhèn)五神廟村(H3)樣品對SMMC-7721細胞抑制效果最好。“諸藥所生，皆有境界”中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論歷來注重“環(huán)境因子”對藥材品質(zhì)的影響，氣候和環(huán)境的多樣性和復(fù)雜性，為藥用植物的多樣性奠定了生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)。因此可推測，造成這一現(xiàn)象的主要原因有可能是其生長的“微環(huán)境”導(dǎo)致了不同產(chǎn)地黑果菝葜化學(xué)成分組成與含量的差異是造成其抗肝癌作用強弱的主要原因。

由于有關(guān)黑果菝葜化學(xué)成分的研究報道較少，本實驗前期也采用LC-MS技術(shù)對落新婦苷、木犀草苷、黃杞苷、槲皮素、槲皮苷和柚皮素等菝葜屬報道的常用成分進行了比對指認，但僅明確了白藜蘆醇這一成分為黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此以此成分作為黑果菝葜的測定指標，對于評價該藥用植物的品質(zhì)具有一定參考意義。本研究建立了黑果菝葜乙酸乙酯部位體外抗腫瘤活性譜效學(xué)模型，得出3個特征峰與抑制肝癌SMMC-7721作用關(guān)聯(lián)性較大，未來針對這些特征峰進行系統(tǒng)研究與成分解析，以期有助于深入挖掘黑果菝葜抗肝癌SMMC-7721作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為同類藥材的抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考，為黑果菝葜臨床用藥提供依據(jù)。