利拉魯肽可能通過AMPK通路減輕2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝小鼠的脂質代謝

朱宏偉，李華，郝芳，劉文軍，李志輝

1.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院內分泌科，內蒙古包頭 014030；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院營養科，內蒙古包頭 014030；3.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院 醫務部，內蒙古包頭 014030

糖尿病（DM）是一種常見的代謝性疾病，其中50%~70%的DM患者為2型糖尿病（T2DM），而T2DM患者更容易合并脂肪肝[1-3]。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）與DM、肥胖和血脂異常等代謝因素密切相關。DM促進NAFLD從過度的肝脂肪沉積向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化甚至肝癌發展，增加了肝臟相關疾病的病死率[4-5]。T2DM的特點是胰島素抵抗和胰腺β細胞病變，導致血糖控制惡化。如果DM藥物或基礎胰島素無法控制機體血糖，需注射一定量的胰島素。但在大多數情況下，由于胰島素劑量不當導致機體血糖紊亂和體質量增加，使脂肪肝進一步惡化。T2DM患者NAFLD的緩解較困難。

胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種腸促激素，由腸細胞分泌。GLP-1在哺乳動物中具有多種功能，包括促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素釋放，減緩胃排空，減少胰島素介導的葡萄糖攝取[6-9]。GLP-1激動劑艾塞那肽、利拉魯肽等作為一類新型的降糖藥物，已在臨床上應用于T2DM的治療。GLP-1激動劑和基礎胰島素聯合治療可協同降低血糖水平，減少餐后血糖水平。但大多數結論來自臨床試驗，其潛在機制仍然未知。報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究動物

KK/upj-ay/J小鼠（以下簡稱為KKay小鼠）雄性60只，SPF級，10～12周齡，體質量28～35 g，隨機分為普通飲食20只，高脂飲食40只，連續飼養4周，4周后每周檢測血糖水平，以確定造模是否成功。KKay小鼠由北京聯合利華提供。

1.2 血糖水平檢測

尾靜脈采少量血，置于血糖儀（羅氏血糖儀，貨號：KDLSZYSZ001），收集數據。

1.3 血液生化分析

尾靜脈采少量血，置于血糖儀空腹過夜后，左心室穿刺采集血樣，室溫靜置3 h后，以3 000 r/min離心10 min。總蛋固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、采用Cobas Integra 400 Plus全自動生化分析儀（Roche Diagnostics,瑞士）測定。

1.4 蛋白質印跡分析

蛋白質印跡分析以研究肝臟組織中蛋白質的表達及其磷酸化水平。將肝臟組織研磨成液體用RIPA裂解緩沖液進行裂解。每組提取的蛋白通過SDS-PAGE分離并轉移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶阻斷非特異性結合，然后用特異性一抗孵育過夜。抗AMPK和抗p-AMPK購自Santa Cruz（Biotechnology,Santa Cruz,CA,United States）。采用Perkinelmer western lightning Plus-ECL檢測特異性條帶。使用Quantity One軟件（Bio-Rad,Hercules，美國）對蛋白質印跡進行密度分析。

1.5 統計方法

采用SPSSVersion19.0（SPSS，Chicago，IL，美國）分析數據，組間比較采用t檢驗和單向ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T2DM合并NAFLD小鼠模型的建立

KKay小鼠高脂飲食4周后，檢測正常飲食組和高脂飲食組小鼠血糖水平，結果發現高脂組小鼠血糖水平均>13.8 mmol/L（前一天饑餓行血糖檢測），血清TC≥6.2 mmol/L，TG≥4.1 mmol/L，見圖1。

圖1 高脂飲食4周促進KKay小鼠血糖、總膽固醇和三酰甘油水平上調

2.2 利拉魯肽改善KKay DM脂肪小鼠的血糖

為了證實利拉魯肽對血糖控制的影響，用利拉魯肽治療T2DMKKay小鼠。利拉魯肽治療12周后，檢測各組小鼠的血糖水平，利拉魯肽組小鼠的血糖明顯低于未治療組，見圖2。

圖2 利拉魯肽改善小鼠血糖濃度

2.3 利拉魯肽緩解體內血脂代謝

利拉魯肽治療12周后，進一步檢測KKay小鼠血脂，包括TC、TG、LDL-C和HDL-C。結果顯示利拉魯肽顯著降低了KKay小鼠的TC、TG和LDL-C水平，輕微降低HDL-C水平，見圖3。

圖3 利拉魯肽改善了小鼠體內血脂的代謝

2.4 AMPK信號通路可能參與利拉魯肽調節的脂質代謝和血糖改變

在體內AMPK通路參與利拉魯肽介導的下游信號轉導。利拉魯肽治療的KKay小鼠肝組織中AMPK信號通路被激活，見圖4。

圖4 蛋白印跡顯示利拉魯肽激活AMPK信號通路

3 討論

NAFLD是世界范圍內常見的肝病，包括NAFL和NASH。脂肪肝可能不會導致嚴重肝功能紊亂。但脂肪性肝炎合并炎癥和纖維化可發展為肝損害并伴有許多并發癥[10]。越來越多的證據表明，T2DM與NAFLD密切相關。在NAFL和NASH患者中，分別有23%和47%被確診為T2DM[11]。目前還未見有針對NAFLD有效的治療藥物，因此NAFLD合并T2DM的患者治療策略更是甚微。GLP-1激動劑作為一種新型的抗DM藥物可以緩解肝細胞的脂質積累和炎癥[12]。然而，其潛在機制尚未完全了解。利拉魯肽與天然GLP-1具有97%的同源性，可以成功延長GLP-1活性，抑制DPP4活性，限制腎臟清除率[13]。文獻報道，除降低血糖外，利拉魯肽對骨、心、腎、肝等不同器官具有保護作用[14]。猜想利拉魯肽可能緩解NAFLD合并T2DM患者血糖和血脂的代謝。結果表明，利拉魯肽能顯著降低血糖和血脂的同時，可以激活AMPK通路。盡管利拉魯肽在減輕肝脂肪堆積方面的作用一直存在爭議，但該研究結論與最近的一篇報道相似，該報道稱，利拉魯肽聯合二甲雙胍顯著降低了T2DM和NAFLD患者的體質量、肝內脂質和內臟脂肪組織[15]。

臨床上，利拉魯肽可以減輕體質量和肝臟脂肪堆積[16]。然而，對其機制的研究仍十分有限。文獻報道AMPK信號通路也參與利拉魯肽刺激的肝臟和脂肪組織的脂肪降解[17]。DPP4抑制劑可以抑制內源性GLP-1的降解，刺激AMPK的激活和脂肪細胞的脂肪變性[18]。在目前的研究中，發現AMPK信號通路可能參與利拉魯肽調控的肝臟相關代謝以及血脂水平。