GMP檢查中發(fā)現(xiàn)微生物檢查方面的常見不足

楊雁莉

（云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院 云南 昆明 650000）

GMP即藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范，GMP要求藥品生產(chǎn)企業(yè)具備良好的生產(chǎn)設(shè)備，合理的生產(chǎn)過程，完善的質(zhì)量管理和嚴格的檢測系統(tǒng)，確保最終產(chǎn)品質(zhì)量符合法規(guī)要求。

微生物檢查作為藥品安全性的重要指標，涉及檢驗項目較多，既包括無菌藥品成品、部分原、輔料的無菌檢查、非無菌藥品的成品、中間品、輔料的微生物限度檢查，直接接觸藥品的包裝材料的微生物限度檢查，制藥用水的微生物檢查，也包括潔凈區(qū)環(huán)境和操作人員的潔凈度檢查，藥品中可能的微生物污染來自水系統(tǒng)、原料、設(shè)備、人員和環(huán)境等，微生物檢查不但能評價藥品本身的衛(wèi)生質(zhì)量，也能客觀的反映生產(chǎn)的過程控制和加工工藝，故而規(guī)范的進行微生物檢查有助于生產(chǎn)合格、有效藥品[1-2]。

自《中國藥典》1995年版正式收載微生物限度檢查法以來，經(jīng)過20多年的努力，檢驗方法日趨完善，并逐漸與國際標準接軌，在2020年版《中國藥典》中又增加了1108中藥飲片微生物限度檢查法，使檢驗方法更加標準、規(guī)范。但有部分檢驗人員沒有接受過微生物專業(yè)技能培訓(xùn)，缺乏無菌操作意識，在實際操作中不能嚴格按照標準操作規(guī)程執(zhí)行，導(dǎo)致檢驗的結(jié)果受許多復(fù)雜因素的影響而易造成誤差。

在近幾年的檢查過程中，主要發(fā)現(xiàn)存在以下問題：

1.對進行無菌檢查、微生物限度檢查所需對照菌株，《中國藥典》有嚴格的規(guī)定，對菌株進行保藏和傳代是藥品微生物檢查質(zhì)量控制的重要一環(huán)。在某些企業(yè)QC實驗室標準儲備菌株和工作菌株未嚴格區(qū)分，標準儲備菌株只可每月或每周1次用于制備轉(zhuǎn)種的工作菌株，工作菌株不能替代標準菌株，從菌種傳代記錄中和菌種管的編碼上就沒有對兩者進行區(qū)分，同一支菌株既用于檢驗又用于轉(zhuǎn)種，導(dǎo)致菌株反復(fù)開啟，易造成轉(zhuǎn)種的新代菌株出現(xiàn)老化、退化、變異、污染等情況[3]。

2.在轉(zhuǎn)種和保藏過程中，還要觀察菌落形態(tài)，注意其生物學(xué)特征典型穩(wěn)定，并做純度、生物特性檢查，如染色鏡檢、生化鑒別等實驗室所需關(guān)鍵指標的確認，轉(zhuǎn)種的菌種出現(xiàn)形態(tài)變異、菌落變異等老化、退化、變異、污染情況，應(yīng)即時滅菌銷毀。但部分藥品生產(chǎn)企業(yè)檢驗人員缺乏相關(guān)經(jīng)驗，只知道傳代次數(shù)超過五代的菌種后才銷毀，不注意確保菌種的活性和純度，檢查時應(yīng)現(xiàn)場查看保藏菌種的情況，同時查看是否有保藏菌種的相關(guān)觀察情況和對關(guān)鍵指標進行確認的記錄。

3.銅綠假單胞菌接種到胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基斜面上傳代培養(yǎng)后，如在冰箱中保存，易發(fā)生菌體自溶而死亡，應(yīng)在室溫保存。但仍有某些微生物檢驗人員不了解該特性，把所用菌種都置于冰箱保存。

4.為了應(yīng)對檢查，只要有相應(yīng)的驗證方案及報告，不管驗證結(jié)果的正確與否。微生物限度檢查做計數(shù)方法適用性試驗時，如發(fā)現(xiàn)供試品有抑菌活性，需要通過增加稀釋液或培養(yǎng)基的體積、加入適宜的中和劑或滅活劑、采用薄膜過濾法等方法單用或聯(lián)合使用來消除供試品的抑菌活性，驗證過程較為復(fù)雜，需操作人員有較強的微生物檢查專業(yè)知識。但某些清熱解毒的中成藥處方含有抗菌作用中藥材，在藥品說明書或藥品宣傳手冊中也提及經(jīng)藥理研究XX藥品具有殺滅常見的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等功效，但部分企業(yè)QC檢驗人員做的該藥品的計數(shù)方法適用性試驗報告中，又顯示該藥品金黃色葡萄球菌等試驗組菌落減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值在0.5～2范圍，沒有抑菌活性，可以采用常規(guī)的平皿法進行微生物限度檢查，自相矛盾。

5.微生物限度檢查供試品的制備，不考慮供試品的理化特性和生物學(xué)特性，供試品一律采用《中國藥典》1105非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法中水溶性供試品制備方法來稀釋供試品進行試驗，而供試品中污染的微生物分布具有隨機性、不均勻性的特點，故而要求供試品不一定要完全溶解于稀釋液中，但要均勻分散，形成均一、穩(wěn)定的供試液分散體系，否則會給實驗結(jié)果引入較大誤差。在做方法適用性試驗前應(yīng)根據(jù)供試品特性（如aw值、pH值、產(chǎn)品的成分和抑菌性），綜合考慮后采取適宜的方法制備供試液，經(jīng)驗證后納入方法適用性報告。

6.2015年版《中國藥典》非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法中，計數(shù)方法適用性試驗要求“試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每1 mL供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100 cfu”。“所加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%”。即從供試液制備就需加入測試用菌株（特殊情況除外），不同于以前測試用平皿中直接加入菌株，這樣使測試用菌株與供試品作用充分，能較好的模擬供試品污染情況，減少系統(tǒng)誤差，但操作步驟也較之前《中國藥典》規(guī)定復(fù)雜，部分藥品生產(chǎn)企業(yè)的計數(shù)方法適用性報告中未體現(xiàn)該步驟的操作過程（如具體描述了多少毫升的供試液加入多少毫升的試驗菌液，每1 mL試驗菌液含菌量大概是多少cfu），只籠統(tǒng)的照抄上述標準，沒有反映真實的試驗過程。

7.某些QC人員未嚴格按照《中國藥典》中微生物檢查方法的要求進行操作，如在檢查現(xiàn)場查看潔凈區(qū)的使用記錄，近期進行了XX批號XX藥品的微生物限度檢查，按時間計算，應(yīng)處于平板培養(yǎng)階段，但在培養(yǎng)箱中只查見胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板；或按檢驗原始記錄顯示供試液制備了兩個稀釋級，每個稀釋級每種培養(yǎng)基制備了各2個平板，但現(xiàn)場培養(yǎng)箱查見的平板，要么少一個稀釋級的平板，要么每個稀釋級只做一個平板；或無菌檢查中培養(yǎng)容器分別按各培養(yǎng)基規(guī)定的溫度培養(yǎng)不少于14 d，部分QC實驗人員認為7 d不長菌后面也不會長，不到14 d即取出處理。

8.微生物檢驗原始記錄中，照抄《中國藥典》的文字敘述，沒有反映真實的檢驗過程，如先敘述“胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在30～35℃培養(yǎng)3～5 d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在20～25℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數(shù)，計數(shù)并報告。”再有一張表格填寫了每種培養(yǎng)基每個稀釋級的菌落數(shù)的點計情況，從其原始檢驗記錄中不能反映在具體在何種溫度條件下進行培養(yǎng)，也沒有反映培養(yǎng)的具體天數(shù)。

9.部分企業(yè)QC實驗室滅菌后培養(yǎng)基的儲存條件和儲存時間未進行驗證。瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，一般不超過一周，且需密閉包裝，曾經(jīng)在藥品生產(chǎn)企業(yè)見到環(huán)境監(jiān)測用的平板，保存期限訂為一月，室溫保存未密封，平板表面已經(jīng)脫水開裂仍準備使用。

10.GB/T 16294-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》中對培養(yǎng)基的要求為“大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）或沙氏培養(yǎng)基（SDA）或用戶認可并經(jīng)驗證了的培養(yǎng)基”，需氧菌計數(shù)采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌計數(shù)采用沙氏培養(yǎng)基，該國家標準要求采用兩種培養(yǎng)基或經(jīng)驗證了的培養(yǎng)基，從而能更全面的反映潔凈區(qū)的污染情況。藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)該根據(jù)實際情況（如地域、季節(jié)，某一階段的污染情況等）進行綜合考察，對在環(huán)境監(jiān)測過程中檢測到的菌落進行鑒定，以確認企業(yè)在環(huán)境監(jiān)測時需采用的培養(yǎng)基類別。某些藥品生產(chǎn)企業(yè)的潔凈區(qū)沉降菌監(jiān)測操作規(guī)程上直接規(guī)定，只采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基監(jiān)測沉降菌，沒有進行考察，無相關(guān)數(shù)據(jù)支持[4]。

11.在進行非無菌藥品微生物限度檢查中控制菌檢查時，不注意選擇正確的限度標準。《中國藥典》2015年版四部通則1107非無菌藥品微生物限度標準，規(guī)定有兼用途徑的制劑，“應(yīng)符合各給藥途徑的標準”，某些企業(yè)會只按常用的給藥途徑進行檢查。另外“含臟器提取物的化學(xué)藥品、生物制品、不含藥材原粉的中藥制劑”、“含動植物源成分或礦物的化學(xué)藥品或生特制品”不得檢出沙門氏菌，這就需要企業(yè)對產(chǎn)品的工藝、原輔料的來源（是否有動物來源，植物、礦物質(zhì)來源的是否經(jīng)過提取）來綜合判斷是否應(yīng)該做沙門菌檢查。

12.GB/T 16294-2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》中，5.3.2項規(guī)定“在動態(tài)測試時，則須記錄生產(chǎn)開始的時間及測試時間”，5.5項規(guī)定“若為動態(tài)測試，則還應(yīng)記錄現(xiàn)場操作人員數(shù)量，現(xiàn)場設(shè)備運轉(zhuǎn)數(shù)量及位置等”，在某些企業(yè)沉降菌動態(tài)監(jiān)測與靜態(tài)監(jiān)測原始記錄共用一個模板，只有簡單的培養(yǎng)皿菌落計數(shù)，記錄無法反映監(jiān)測時的真實情況，如在某個采樣點，從開始生產(chǎn)到結(jié)果用了幾個培養(yǎng)皿，各皿的菌落計數(shù)等[5]。

規(guī)范地進行微生物檢查，“人”是最關(guān)鍵的因素，大部分的缺陷都可歸結(jié)到人員培訓(xùn)不到位上，故而從事藥品微生物檢查工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近的專業(yè)知識背景，并應(yīng)加強對微生物專業(yè)知識和操作技能的培訓(xùn)，如微生物專業(yè)知識，無菌操作，培養(yǎng)基制備、消毒滅菌、貯藏，菌種鑒定、傳代、保藏，無菌檢查方法、微生物檢查方法、潔凈區(qū)域的微生物監(jiān)測，經(jīng)考核后合格方能上崗。