實時熒光定量PCR檢測痰及血液中結(jié)核桿菌的臨床應(yīng)用研究

文 /易瓊英，王甜恬

肺結(jié)核疾病的致病菌為結(jié)核桿菌。結(jié)核桿菌在傳播過程中，受體細(xì)胞的免疫功能降低，同時，還會對患者多處器官造成損傷。據(jù)有關(guān)統(tǒng)計表明：國內(nèi)肺結(jié)核的發(fā)病率相對較高，且逐年提升。所以，肺結(jié)核需要做好早期診斷，才能夠有效控制傳染，還可以對患者的預(yù)后效果產(chǎn)生良好的改善作用。由此可見，通過有效的診斷方法對結(jié)核病患者的病情進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，意義重大[1]。因此，作者抽取我院于2019年08月至2020年12月期間收治的結(jié)核病患者508例作為研究對象，分析實時熒光定量PCR檢測法的檢測效果，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院于2019年08月至2020年12月期間收治的結(jié)核病患者508例作為研究對象，其中269例女性患者，239例男性患者，年齡范圍在23-64歲之間，平均年齡為（52.21±5.76）歲，病程范圍在2個月到12年之間，平均病程為（8.46±3.46）年。通過CT以及X線檢查，患者的雙肺紋理增多，并且變粗，部分患者還會出現(xiàn)胸痛、胸悶等情況。

1.2 方法

一方面，于清晨，采集患者的痰標(biāo)本，將患者的痰標(biāo)本和健康人群的痰標(biāo)本進(jìn)行對比。首先需要使用雙氧水漱口，防止檢測受到影響。患者用力咳嗽，采集第二次痰液，使用無菌器皿裝好送檢，連續(xù)三天獲取痰標(biāo)本做檢測，通過鏡檢，對結(jié)核桿菌的陽性率進(jìn)行統(tǒng)計。余下的痰液用三倍量的4%濃度的NaOH混相混合，然后進(jìn)行室溫液化，持續(xù)20分鐘，之后離心5分鐘，獲取上清液，然后震蕩處理，再以15000r/min的速度進(jìn)行離心，持續(xù)十分鐘，進(jìn)行至少兩次的去離子水沉淀；另一方面：采集外周血。于清晨，抽取患者空腹?fàn)顟B(tài)下5ml靜脈血，將血液標(biāo)本和EDTA凝膠相混合，做抗凝處理，然后棄置血漿，紅細(xì)胞被滅菌高純水溶解之后，再次離心十分鐘，除去上清液，在沉淀標(biāo)本中加入50μL DNA提取液震蕩，然后離心5s，然后進(jìn)行沸水浴，持續(xù)10分鐘，之后將其放入4℃的水中半小時，之后轉(zhuǎn)入100℃的水浴中做離心處理，保存上清液備用，裂解物在-20℃的環(huán)境下密閉保存，然后使用紫外分光光度計對RNA的濃度以及純度進(jìn)行測定。

實時熒光定量PCR技術(shù)：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒上的說明書操作。使用25μl反應(yīng)指標(biāo)作為檢測樣本的判定標(biāo)準(zhǔn)。β-actin反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)為：72℃延伸三十秒，94℃變形三十秒，94℃預(yù)變性兩分鐘，63℃退火三十秒，共36個循環(huán)，然后以擴(kuò)增條件為檢驗，72℃延伸三十秒，94℃變形30s，94℃預(yù)變性2分鐘，64℃退火30s，共42個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

PCR痰定量陽性率為46.26%（235/508），痰涂片陽性率為14.96%（76/508），PCR外周血定量陽性率為59.84%（304/508），外周血定量陽性率和痰定量陽性率要高于痰涂片陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

肺結(jié)核患者的病理診斷需要將觀察到的典型結(jié)核結(jié)節(jié)作為診斷依據(jù)，對于已經(jīng)滲出的病變類型，典型結(jié)核結(jié)節(jié)并不常見，所以，臨床中準(zhǔn)確診斷的難度較大，具有一定的局限性。隨著PCR技術(shù)逐漸發(fā)展，檢測效率大大提升。通過熒光定量PCR檢測法，可以對靶基因序列有效鑒別，通過熒光標(biāo)記寡核苷酸探針擴(kuò)增，對特異性熒光進(jìn)行探測，然后通過對熒光值的增加情況進(jìn)行檢測，進(jìn)而提高臨床確診率[2]。

熒光定量PCR檢測法的原理是通過利用結(jié)核分枝桿菌的特異性，以及其熒光反應(yīng)，判定結(jié)核桿菌。通分析PCR反應(yīng)液和耐熱DNA聚合酶的變化情況，然后和4種核苷酸單體相結(jié)合，作出判斷。通過體外擴(kuò)增法檢測時，對于結(jié)合分枝桿菌基因的判斷率顯著提升。但是，該方法還尚不成熟，除此之外，對標(biāo)本中的結(jié)核桿菌含量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，其不會被細(xì)胞表型的內(nèi)在所影響，特異性以及靈敏度較高，結(jié)核桿菌的測定結(jié)果準(zhǔn)確率以及實效性明顯提升[3]。

本次研究結(jié)果表明：PCR痰定量陽性率為46.26%（235/508），痰涂片陽性率為14.96%（76/508），PCR外周血定量陽性率為59.84%（304/508），外周血定量陽性率和痰定量陽性率要高于痰涂片陽性率。

綜上所述，通過熒光定量PCR技術(shù)檢測痰液和外周血中的結(jié)核桿菌來診斷肺結(jié)核，其陽性率明顯提升，臨床診斷精準(zhǔn)度較高，值得推廣。