短串聯重復序列分型檢測應用的研究進展

李 娟，慕 力，李旭婧，史 麗，簡小聰

（協和干細胞基因工程有限公司 天津 300384）

短串聯重復序列（STR）是指重復單位長度為2～6 bp的重復序列，也稱為微衛星序列，包括位于中間的核心序列和位于外圍的側翼區，其高度的多態性源于核心序列的重復次數的不同，具有個體特征，在人類全基因組均勻的分布。作為一個重要的遺傳標記系統，STR基因座還具有以下特點：（1）重復序列串聯排列，多態性好；（2）產物片段在500 bp以下，對DNA質量要求低，易于擴增；（3）靈敏度高；（4）擴增片段相近，擴增條件相似，可進行復合擴增；（5）位點信息明確，可實現標準化和自動化。STR被稱作第二代DNA指紋技術，并已廣泛用于法醫DNA分析、遺傳制圖、連鎖分析、親權鑒定、細胞株鑒定、個體識別、疾病基因定位、移植后嵌合和物種多態性研究等領域[1]。

熒光標記多重擴增結合毛細管電泳（CE）的分型檢測技術是目前STR分型最主要的手段，其分型策略是長度多態性檢測，根據微衛星DNA兩端序列的保守性，設計一對特異引物，利用PCR技術，將STR基因座擴增出來，得到的PCR產物帶有熒光信號在毛細管電泳過程中可以被探測并識別。采集到的熒光信號經過分析比對，轉換為基因型數據，最終推算出STR重復單位的重復次數，從而獲得位基因分型。

1.STR在親權鑒定中的應用

STR片段分析具有以下特性：（1）除同卵雙生外，每個人包含的DNA序列是獨一無二的；（2）同一個個體的各種組織DNA具有相同的序列特征；（3）同一個個體的DNA序列在一生當中保持不變（除某些疾病外）；（4）同一個個體的DNA一半來自母親，一半來自父親。以ABI公司出品的GlobalFiler親子鑒定試劑盒舉例，該試劑盒能檢測23個位點，其隨機匹配概率高達7×10-27。在伍新堯等[2]研究的親權判斷標準中關于親子鑒定的結果判讀為三聯體親權鑒定至少要檢測15個STR基因座，出現1個矛盾基因座，就需要增加至19個基因座；出現2個矛盾基因座，就需要增加至28個基因座；出現3個矛盾基因座，就需要增加至35個或以上基因座，若未再出現新的矛盾基因座，通過矛盾基因座的父權指數來計算出累積父權指數（CPI），若達到或超過10 000（父權概率為0.9 999），可以做出“肯定親生關系”的結論。若出現4個矛盾基因座，則直接做出“非親生關系”結論。單親親子鑒定至少要檢測18個STR基因座，若發現1個矛盾基因座，就需要增加至29個或以上基因座；若發現2個矛盾基因座，則需要增加至41個或以上基因座。將矛盾基因座的父權指數計算CPI，若達到或超過10 000，可以做出“不排除親生關系”或“支持存在親生關系”的結論。若發現3個矛盾基因座，則直接作出否定“親生關系”的結論。

2.STR在細胞株的鑒定中的應用

應用于生物醫學領域的細胞被錯誤鑒定和交叉污染的問題，稱為科研界迫切需要解決的質量控制問題。德國細胞庫對人類細胞系原始庫調查交叉污染時做的252株新建系細胞有18%的細胞系存在交叉污染，伊朗的細胞庫中也有近18.8%的污染率[3]，而階段性的鑒定也是必須的，因為細胞經過反復傳代后，突變和交叉污染的概率極大。所以實驗中對所用的細胞系進行質量控制，排除錯誤和發生交叉污染的細胞，使后續結果更為準確、客觀。美國國立衛生研究院和美國典型培養物保藏中心（ATCC）等機構建議在實驗前需要對所使用細胞系進行準確鑒定。雖然用于細胞鑒別的技術有很多，包括染色體檢查、同工酶譜檢測、PCR檢測及STR基因分型。然而都具有其相應的缺點：染色體檢查對人員技術要求較高，同工酶檢測只能用于鑒定細胞種屬，且操作繁瑣；研究表明進行細胞交叉污染和性質鑒定的金標準是STR基因分型檢測。STR基因分型應用于細胞鑒定已被ATCC等機構強烈推薦。鑒定流程包括提取細胞的基因組DNA，熒光引物PCR擴增STR位點，PCR產物毛細管電泳，專業軟件分析。最后是與STR的數據庫比對，比對數據庫為美國的ATCC細胞庫、德國菌種保藏中心、日本研究用生物資源保藏中心。ATCC網站的人源細胞STR鑒定結果判定標準為：受檢細胞STR位點的基因分型數據與其對應的標準細胞系STR基因分型數據進行比對：（1）若兩者的匹配度為100%，則判定受檢細胞系為ATCC STR數據庫中標準細胞系。（2）若兩者的匹配度80%～99%，則判定受檢細胞系為ATCC STR數據庫中標準細胞系的衍生細胞系。（3）若兩者的匹配度57%～79%，建議結合細胞系形態、細胞系特異性標記物等輔助分析進行綜合判斷。（4）若兩者的匹配度≤56%，則判定受檢細胞樣本與其對應的標準細胞系不相關。

3.STR在異基因造血干細胞移植中的應用

異基因造血干細胞移植中因為移植物的抗白血病效應，現今已經成為臨床上各種惡性及非惡性血液病治療的一項重要措施[4]，移植后的療效、移植后出現的移植物排斥、移植物抗宿主病（GVHD）、原發疾病復發及均與供受者造血及免疫系統的嵌合狀態密切相關[5]，供者細胞植入受者體內后供者細胞及受者細胞含量情況是動態變化的，動態定期監測供受者細胞嵌合率可以及早發現排斥、復發并及時干預治療，對降低移植后復發率，有效控制GVHD，提高患者的生存率具有十分重要的意義。

嵌合狀態指的是在異基因造血干細胞移植后，供者細胞植入到受者體內，供受者雙方的造血細胞達到共存的現象。移植后供者細胞在受者細胞的百分比即為供者細胞嵌合率；異基因造血干細胞移植之后可出現三種狀態：（1）完全供者嵌合狀態，是指供者細胞占受者的骨髓或外周血細胞的比例≥99%，此時可以是認為當時檢測的時間點是移植成功的，沒有復發；（2）供受者混合嵌合（供者細胞嵌合率5%～95%），是指檢測結果中既有患者細胞又有供者細胞，此時是否是一個供者細胞正在增殖或者是復發的狀態，需要一個連續的監測過程確認；（3）完全受者型（供者細胞嵌合率＜5%），此狀態表明的結果是移植失敗或者完全復發，同樣需要一個連續的監測過程確認。

至今嵌合率的檢測方法主要有熒光原位雜交（FISH）技術、可變串聯重復序列（VNTR）、實時定量聚合酶鏈式反應（RQ_PCR）檢測和STR. FISH技術的優點在于敏感性高、可定量、快速、安全，但只能應用于異性別移植后嵌合率監測，VNTR與STR的敏感性及特異性均較高，檢測所需的細胞量也較少，且適用于幾乎全部供受者。但VNTR為人類DNA含有可變數串聯重復序列的多態性位點，由長度為8～50 bp的重復序列組成；而STR則為長度2～6 bp的重復序列，可以顯示出高度的雜合性、多態性及個體化[3]，比VNTR敏感性更高。RQ-PCR檢測操作簡單迅速，所需細胞量較少，且檢測敏感性較高，但其缺點是前期需要通過復雜的篩選得到合適的供者[6]因此STR被廣泛應用于移植后嵌合率的分析，是目前供者造血細胞植入和患者自體細胞殘留監測的標準化方法，并且房建成老師還開發了一套基于毛細管電泳法進行移植后嵌合率檢測時可自動數據分析和報告的工具軟件，以提高工作效率[7]，滿足了實驗室對數據管理規范化的要求，也實現檢測信息的數據庫化管理。

4.結語與展望

雖然STR分型檢測技術因其高靈敏度、高特異性、高鑒別能力在多個領域廣泛應用，但在鑒定實踐中利用CE技術進行PCR-STR分型是基于其長度多態性，而忽略了其序列多態性[8]。而序列多態性可以增強STR遺傳標記的多態性，是個體識別或親緣關系分析的寶貴資源，可提高其識別效能。隨著二代測序（NGS）技術的不斷成熟和推廣，其高通量、集成化、低成本、快速等優勢不斷的顯現出來，龐敬博的調查研究表明NGS技術不但能夠檢測遺傳標記的DNA序列，而且可以使基于PCR技術的DNA片段長度多態性和DNA序列多態性結合，從而得到基因座中所有序列長度相等可能具有遺傳穩定性的完全不同的等位基因，以提高遺傳標記的應用效能。即基于NGS進行STR序列多態性分型所獲得的等位基因數量遠多于基于CE平臺的STR長度多態性分型，并且由長度多態水平擴展到序列多態水平，對STR等位基因進行更為精細化的區分，提供全解析度的STR數據支撐，顯著提升了STR基因座的個體識別效力[9]和檢測系統的效能，也能夠提高對微量和降解檢材的檢驗能力[10]。并且通過在目的基因兩端連接特異性的標記序列來識別不同樣本，可以同時檢測數十上百個樣本，大大提高檢測效率，為其發展提供了更廣闊的空間和更多樣化的應用前景。