血漿腎素水平評價方法的研究進展

秦飛，祝珊珊，陳丹，許莉

(廈門醫學院，福建 廈門 361023)

高血壓是一個全球性的公共衛生問題。我國高血壓患者約2.45 億，目前患病率仍呈上升趨勢，知曉率、治療率、控制率卻較低[1]。高血壓如不及時治療會導致腦血管疾病、心臟疾病、腎臟疾病、糖尿病等。因此，早期發現與治療對預防相關慢性疾病至關重要。腎素-血管緊張素-醛固酮(RAAS)系統是調節人體水、電解質平衡以及血容量、血管張力和血壓的激素鏈之一，RAAS系統失調將導致腎性高血壓、內分泌型高血壓，其主要調控因素腎素的檢測，在高血壓的診斷中發揮著重要作用。腎素是腎臟球旁復合體的球旁細胞釋放的一種蛋白水解酶，分子量為37 kD，腎素分子結構復雜以及低豐度的特征，使其檢測變得困難，目前尚沒有標準化的檢測方法。因此建立與完善一種易于操作、耗時較短、結果可比的標準化方法在腎素的臨床檢測中具有重要意義。

1 腎素水平評價的臨床意義

腎素是RAAS系統的主要調控因素，當血壓降低時，腎臟分泌腎素釋放到血液中，腎素催化肝臟分泌的血管緊張素原水解產生血管緊張素Ⅰ(Ang-Ⅰ)，Ang-Ⅰ經過肺、腎等臟器時，經血管緊張素轉化酶剪切C-末端兩個氨基酸殘基生成血管緊張素Ⅱ(Ang-Ⅱ)。Ang-Ⅱ具有高效的收縮血管作用，使血壓升高；Ang-Ⅱ也能刺激腎上腺皮質分泌醛固酮，醛固酮能促進腎臟對水和鈉離子的重吸收，繼而增加體液容量，升高血壓。因此血漿腎素活性測定對于明確高血壓的發病機制、指導治療和評價預后有參考價值。崔淑嫻等[2]比較了高血壓合并焦慮抑郁患者和原發性高血壓患者的血漿腎素活性、醛固酮水平及血壓變異性，發現高血壓并焦慮抑郁患者臥位、立位血漿腎素活性及醛固酮水平明顯高于原發性高血壓患者，提示RAAS激活參與了焦慮抑郁患者的高血壓發病過程，為降壓藥物的選擇提供了理論依據，降壓藥物選用長效RAAS抑制劑為最佳。吳冰等[3]研究了血漿醛固酮/腎素濃度比值(ADRR)對原發性醛固酮增多癥(PA)的診斷價值，結果表明，ADRR可作為篩查PA的一種有效指標，并建議用25作為立位ADRR初篩的臨界值。李寧等[4]研究了尿醛固酮/血漿腎素活性比值(UARR)在PA篩查中的價值，立位UAPP的最佳臨界點為5.1 ng·mL-1·h-1，靈敏度為92.13%，特異度為91.18%，結果表明，立位UARR也是一種有效的PA篩查指標。2016年的中國《原發性醛固酮增多癥診斷治療的專家共識》[5]以及同年美國內分泌協會更新的原發性醛固酮增多癥臨床實踐指南[6]均建議用醛固酮/腎素比值來進行PA的初篩和診斷，其中腎素的檢測包括兩種方法，腎素活性(PRA)以及腎素濃度(PRC)，前者通過測定Ang-Ⅰ的產生速率來反映腎素活性，后者則是直接測定血漿腎素濃度。

2 腎素活性檢測方法

PRA檢測的常規步驟是在一定溫度和pH值條件下孵育血漿，使血管緊張素原在腎素作用下轉化為Ang-Ⅰ，同時加入血管緊張素轉化酶抑制劑，抑制Ang-Ⅰ進一步轉化為Ang-Ⅱ，而后通過冰浴或化學方法終止反應，測定Ang-Ⅰ的生成量，結合孵育時間計算PRA，Ang-Ⅰ的產生速率越快則腎素活性越強。其中，Ang-Ⅰ的定量方法主要有免疫學分析法和質譜法。

2.1 免疫學分析法

1969年Boyd等[7]首先提出將放射免疫法(RIA)用于PRA的評價，經過幾十年的改進，RIA已成為臨床實驗室常用方法。該方法以125I標記的Ang-Ⅰ作為競爭抗原，通過競爭結合來定量待測樣品中的Ang-Ⅰ。RIA法發展較早，技術成熟，但實際應用中仍存在明顯的問題。首先RIA檢測Ang-Ⅰ是基于競爭性結合原則，所使用的抗體同時可以與其他內源性血管緊張素進行非特異性結合，這種潛在的交叉反應性會高估腎素活性。此外，RIA法還存在難以自動化、線性范圍窄、產生放射性污染等問題，臨床應用中有一定的局限性。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測PRA也有報道，但是該方法的靈敏度不如RIA，限制了其實際應用[8]。

2.2 質譜法

質譜法的高特異性、高靈敏度、低檢測限等優勢使其在醫學檢驗領域的應用越來越廣泛，在血液或體液中氨基酸、肽、維生素、激素、血藥濃度、微量元素等微量或恒量物質的定性定量檢測中都有應用。用于PRA評價的質譜方法主要有兩種：電噴霧質譜(LC/ESI-MS/MS)和免疫基質輔助激光解離質譜(iMALDI-MS)。前者在孵育結束后對Ang-Ⅰ進行固相萃取，再通過液相色譜洗脫后直接測定Ang-Ⅰ濃度；后者在孵育結束后首先用抗體修飾的磁性顆粒捕獲Ang-Ⅰ，通過磁分離后，再用MALDI質譜進行定量。徐雯等[9]建立了血漿PRA的液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)檢測方法，該方法的特異性、重復性、基質效應等均在臨床可接受范圍，定量下限為0.084 4 ng·mL-1·h-1，線性范圍為0.084 4～30.000 0 ng/mL，線性相關系數r2=0.99，與RIA結果相比，兩者結果一致性較好；RIA的診斷特異性(99.4%)優于LC-MS/MS(91.0%)，但靈敏度(33.3%)遠不及LC-MS/MS(96.3%)。該方法目前已在復旦大學附屬中山醫院臨床應用。Camenzind等[10]建立了PRA的iMALDI-MS分析方法，與RIA及LC-MS/MS的檢測結果均表現出良好的相關性(iMALDI-MS與RIA，r2=0.941 2；iMALDI-MS與LC-MS/MS，r2=0.947 1)，與RIA法相比，iMALDI-MS的優勢是通過抗體富集Ang-Ⅰ，不存在放射性污染；富集后再使用質譜對特定目標物分子量進行篩選檢測，消除了非特異性吸附的影響，克服了RIA的最大不足。與免疫學分析方法相比，質譜檢測的靈敏度更高、分析時間更短，且無需用到放射性核苷酸。但質譜儀器價格昂貴并需要專人操作維護，且測量性能遠不能滿足國際臨床化學與檢驗醫學聯合會對參考方法測量性能的要求[11]，在方法標準化方面仍需要進行大量探究工作。

3 腎素濃度檢測

化學發光免疫法(CLIA)是近年來發展起來的PRC檢測方法，檢測原理是基于雙抗夾心，抗體一為包被在磁微粒上的能識別腎素的特異性單克隆抗體，抗體二為結合了發光底物的腎素特有的單克隆抗體，待測物與兩種抗體同時加入反應體系進行孵育后沖洗，同時結合兩種抗體的被測物，在催化劑作用下產生光信號，發光強度與被測物濃度成正相關[12]。對CLIA法及傳統RIA法檢測性能的對比研究已有大量報道，黃富亮和高通[13]比較分析了兩種方法的準確性、精密度及線性范圍的差異。CLIA法回收率(99.1%～102.3%)優于RIA法的回收率(94.2%～108.9%)，表明CLIA方法準確性更高；CLIA法的批間變異系數小于RIA法(P<0.01)，但批內變異系數大于RIA法(P<0.01)，表明CLIA法的精密度略差；兩種方法檢測的相關性良好(r=0.996，P<0.01)，CLIA法的線性范圍(25～850 pg/mL)大于RIA法線性范圍(22～700 pg/mL)。黃盼等[14]采用CLIA法檢測血漿PRC，探討了血漿醛固酮/腎素濃度比值在PA篩查中的診斷價值，為臨床診斷PA提供了參考。文獻指出采用CLIA法較傳統RIA法具有靈敏度高、穩定、可重復性、容易操作等優點。CLIA法直接測定PRC，無需進行血漿孵育，自動化程度高，可進行批量檢測，并且無放射性污染。與PRA檢測相比，用該方法直接測定PRC更加簡單易行，但考慮腎素濃度與腎素活性評價在臨床診斷中的相關性，此方法目前在國內未廣泛開展，仍有待于進行較全面的評價，為臨床應用提供參考[12]。

4 挑戰與展望

腎素在血漿中含量低，分子結構復雜，且臨床中影響腎素檢測的因素較多，如采樣時間、采樣體位等，因此腎素水平評價屬于較復雜的檢測項目。目前用于腎素水平評價的兩種方法：PRA檢測及PRC檢測，在檢測結果相關性方面，不少研究者對其準確性、精密度、線性范圍、參考值范圍等檢測性能進行了對比，但是由于各實驗室間樣本地區、數量、實驗室儀器等存在差異，各項目對比結果不盡相同。濃度檢測結果雖不能完全優于活性檢測，但是可自動化、不產生放射性污染等顯著優勢使其有望替代活性檢測，用于臨床高血壓等相關疾病的診斷。目前國內已有北京、上海、廣州等少量醫院開展了腎素濃度評價。我國目前仍未開展腎素的全國內分泌室間質量評價(EQA)計劃，缺少各檢測系統內和系統間的基線數據。在臨床各方面的推動下，國家衛生健康委員會臨床檢驗中心同國家高血壓專病醫聯體、高血壓認證中心于2019年7月在桂林啟動了腎素醛固酮標準化項目。此項目計劃利用WHO國際標準品作為腎素溯源鏈的頂端，研制具有互通性的參考物質，開展腎素一致化計劃，以期改進腎素的檢測現狀，實現腎素檢測結果的互通可比性[15]。