自噬的分子機制及其在心臟驟停腦損傷中的作用研究進展

胡星平，秦開秀

（重慶醫科大學附屬第二醫院急診科，重慶 404006）

心臟驟停是指心臟射血功能突然終止，重要器官出現嚴重缺血、缺氧，導致生命終止的一種急性疾病。大多數心臟驟停患者死于急性事件，但大部分心臟驟停死亡發生在心肺復蘇成功后的患者中。腦組織對缺血缺氧極其敏感，心臟驟停不僅可損害全身器官系統，還可對神經系統造成嚴重損傷。心臟驟停后腦損傷是導致患者高死亡率的關鍵因素之一。有證據表明，心臟驟停腦損傷會引起患者死亡，院外患者死亡率為68%，院內患者的死亡率為23%[1]。因此，探討心肺復蘇后腦損傷的相關機制，尋找改善神經功能新的治療靶點十分必要。自噬廣泛存在于正常的生理過程中，可清除細胞廢物，促進結構重建與細胞的生長分化，同時也參與多種疾病的病理過程。近年來，自噬作為一種新的程序性細胞死亡方式，越來越受到國內外學者的重視。現將自噬與心臟驟停患者心肺復蘇后腦損傷的機制綜述如下。

1 自噬

1962年，Ashford和Porter在顯微鏡下觀察到細胞“自己吃自己”的現象。1963年，比利時生物學家Christian de Duve正式將此現象命名為“自噬”。自噬是指真核細胞通過溶酶體降解來消除細胞質物質的進化機制，其是發生在所有真核細胞中的主要降解途徑。細胞自噬是一種不同于凋亡的程序化細胞內降解機制，細胞可通過溶酶體降解自身胞質成分來實現自身的代謝需要和某些細胞器的更新，從而維持細胞內環境穩態。自噬參與多臟器功能的保護與損害，且與機體外各種刺激相關，是全球研究熱點。自噬是一把“雙刃劍”，在不同的應激狀態下作用各不相同，既可對機體起保護作用，也會導致機體進一步損傷。

2 自噬的分類

自噬可根據細胞將內容物運輸至溶酶體腔內的3個不同途徑分為微自噬、分子伴侶介導的自噬（CMA）及大自噬。微自噬是內容物被溶酶體直接吞噬的降解過程；CMA主要依賴于胞漿內分子伴侶hsc70對帶有KFERQ序列的內容物的識別與結合，結合形成的復合物與溶酶體相關的膜蛋白2（LAMP2a）再結合，將內容物運輸至溶酶體中被降解；大自噬依賴于雙膜囊泡，即內容物在雙膜囊泡內被隔離，形成一個自噬體，隨后與溶酶體或液泡融合使其降解，也就是形成所謂的自溶酶體[2]。大自噬是自噬最普遍的形式，是一種進化保守的動態途徑。大自噬在正常生理水平上發揮作用，可保護包括內質網和線粒體在內的幾個亞細胞室的結構和活性。因此，在沒有外界干擾的情況下，神經元的存活需要中樞神經系統中具有正常的自噬功能。大自噬不足或過量，都會嚴重損害細胞的生理功能，故需要進行適當的調控。

3 調節自噬的信號通路

3.1 依賴mTOR信號通路

mTOR是雷帕霉素（rapamycin）或西羅莫司（sirolimus）分子的靶標，是一種不典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷酸肌醇激酶3（PI3K）相關激酶家族的一種，其可與多種蛋白相互作用，形成雷帕霉素復合1（mTORC1）和雷帕霉素復合2（mTORC2）兩個不同的復合物。mTORC1促進蛋白質與脂質的合成、細胞生長與合成代謝，其可通過阻止自噬抑制細胞分解代謝；相反，mTORC2調節細胞存活、細胞增殖及代謝。與自噬有關的主要是mTORC1，且mTORC1負反饋調控自噬。mTORC2可通過激活mTORC1間接抑制自噬。在營養豐富的條件下，哺乳動物中的mTORC1通過直接磷酸化和抑制由unc-51樣激酶1（ULK1）、自噬相關基因13（ATG13）與FIP200組成的蛋白復合物來調控自噬。相反，營養物缺乏也可刺激ULK1/ATG13/FIP200復合物的形成，并通過ULK1自身磷酸化及其結合配偶體的磷酸化啟動自噬[3]。

3.1.1 AMPK-mTOR信號通路 AMPK-mTOR是參與自噬調節的主要信號途徑之一。AMP活化蛋白激酶（AMPK）是一種代謝應激敏感酶，負責維持細胞能量穩態，腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）產量輕微下降時會導致一磷酸腺苷（AMP）或二磷酸腺苷（ADP）的相對增加，此時AMPK會被激活。AMPK作為一種重要的生理能量傳感器，激活后可以誘導自噬，其調控的主要機制是AMPK直接磷酸化T1227和S1345上的結節性硬化癥基因2（TSC2，也被稱為結核素），增強Rheb-GAP活性，從而抑制哺乳動物mTORC1[4]。AMPK也能夠通過磷酸化mTORC1結合伙伴raptor，從而負向調控mTOR。

3.1.2 PI3K-Akt-mTOR信號通路 磷脂酰肌醇3-激酶(P13K)是一類脂質激酶，可根據其不同的結構和脂質底物分為三類（第Ⅰ類、第Ⅱ類及第Ⅲ類），而與自噬有關的主要是第Ⅰ類。PI3K是酪氨酸激酶受體的底物，其可導致絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（Akt）磷酸化，進而調節細胞存活。PI3K活化導致Akt磷酸化，隨后磷酸化的Akt促進mTOR信號通路的磷酸化和活化。Akt磷酸化觸發結節性硬化癥基因1/2（TSC1/2），進而刺激mTOR抑制下游自噬啟動激酶ULK1，導致自噬終止[5]。

3.2 非mTOR信號通路

3.2.1 ROS-自噬信號通路 活性氧（ROS）主要包括一系列含氧的高活性物質，如氧陰離子、自由基及過氧化氫（H2O2）。隨著氧化應激反應的升高，ROS的過量產生會分別激活缺氧誘導因子（HIF-1）、腫瘤抑制蛋白（p53）、轉錄因子叉頭蛋白3（FOXO3）及細胞轉錄因子NF-E2相關因子2（NRF2），分別誘導凋亡線粒體蛋白（BNIP3）、NIX基因、腫瘤蛋白53誘導的糖酵解和凋亡的調控子（TIGAR）、微管相關蛋白輕鏈3（LC3）、BNIP3及p62蛋白的轉錄，最終促使相應蛋白產物在細胞質中誘導自噬[6]。研究發現，ROS可以通過轉錄因子EB（TFEB）調節自噬，TFEB是溶酶體生物發生和自噬的主要調控因子，通過線粒體損傷或外源性增加ROS水平，直接激活MCOLN1，誘導溶酶體Ca2+釋放，觸發PPP3/鈣調蛋白依賴的TFEB核易位，增強自噬[7]。

3.2.2 PKC-自噬信號通路 蛋白激酶C（PKC）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，以細胞類型特異性的方式調控多種細胞功能，其活性又受絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸磷酸化調控。PKC是一種自噬調節劑，可以通過介導細胞成分的自噬來幫助維持細胞穩態。研究表明，PKC通過調節下游的raf1和JNK信號而激活自噬[8]。但也有研究表明，PKC抑制劑可觸發自噬，而PKC激活劑可抑制饑餓或雷帕霉素誘導的自噬[9]。

3.2.3 內質網應激-?自噬信號通路 內質網應激是一種常見的細胞應激反應，不同的細胞壓力，如Ca2+穩態的擾動、氧化還原失衡及蛋白質折疊缺陷等，均會導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質在內質網（ER）腔內積聚。內質網應激會引發自噬，細胞在內質網應激下，激活一系列互補的適應機制，以應對蛋白折疊的改變，稱為未折疊蛋白反應（UPR）。UPR是一種高度保守的機制，使細胞能夠響應和解決內質網應激。UPR的3個典型分支在誘導、囊泡成核和伸長的不同階段調節自噬，導致Beclin-1/Bcl-2復合物的破壞，從而釋放出自噬基因Beclin-1，或通過x-box綁定蛋白1（XBP-1）介導的轉錄因子激活Beclin-1[10]。

3.2.4 C9orf72-自噬信號通路 9號染色體開放閱讀框72（C9orf72）參與中樞神經系統（CNS）大自噬的微調。有報道指出，C9orf72在自噬中的作用為C9orf72下調后可導致自噬起始的減少[11]。C9orf72可影響FIP200/ULK1自噬起始復合物的功能，但也可能調節mTOR信號通路和TFEB，從而促進自噬。

4 自噬在腦損傷中的保護作用

4.1 激活自噬機制

研究發現，通過雷帕霉素治療可顯著增加自主循環恢復（ROSC）后LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達，促進神經元存活，減少神經元凋亡，改善心肺復蘇后神經功能缺損評分[12]。在心臟驟停后輕度亞低溫是唯一可以改善神經系統預后的治療。肖鹽等[13]通過建立SD大鼠窒息性心臟驟停-?心肺復蘇模型，運用蛋白質印跡法檢測自噬相關蛋白Beclin-1和LC3、凋亡相關蛋白Bcl-2和caspase-3、Ⅲ型PI3K通路蛋白Vps34和Atg14，透射電鏡觀察腦組織超微結構的變化，并在ROSC后48 h進行神經功能缺損評分（NDS）評估，結果顯示，亞低溫治療可減輕心肺復蘇后腦水腫，改善腦功能，其可能與激活Ⅲ型PI3K通路增加自噬、抑制凋亡調節有關。脂聯素（APN）可通過降低心臟驟停-?心肺復蘇誘導的GCIR小鼠腦組織中裂解的caspase-3的表達來抑制細胞凋亡，并促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。研究證明，APN通過促進自噬保護神經元免受損傷誘導的過度凋亡，可能機制是通過激活AMPK和減輕氧化應激來促進鈣-?心肺復蘇后的神經元自噬[14]。此外，ZHU等[15]應用二甲雙胍預處理模型大鼠，觀察心臟驟停后繼發腦損傷的情況，發現二甲雙胍通過增加AMPK依賴性自噬，對心肺復蘇后缺血性腦損傷具有神經保護作用。

4.2 抑制自噬機制

也有研究證實，亞低溫治療可通過抑制自噬與神經元凋亡來減輕心肺復蘇后腦損傷；在關于右美托咪定在腦缺血再灌注損傷的研究中發現，右美托咪定治療可通過抑制自噬與誘導低溫，減少神經元損傷，改善神經功能[16]。CUI等[17]在8 min 心臟驟停后心肺復蘇大鼠模型中，研究自噬和p53信號通路是否在腦缺血再灌注損傷（I/R）后海馬神經元凋亡中發揮作用；通過檢測心臟驟停后組織蛋白酶B、D、Beclin-1、p53、自噬調節劑（DRAM）、Bax、凋亡調節劑（PUMA）的變化，說明自噬激活部分由p53介導，并參與心臟驟停后海馬神經元凋亡，自噬抑制劑3-MA和溶酶體抑制劑BFA均能抑制心臟驟停后的自噬和凋亡活化，促進神經存活。p53-specific抑制劑PFT-α和自噬抑制劑3-MA可有效抑制DRAM和LC3-II的表達，從而發揮神經保護作用。在其他干預措施，如硫化氫在心肺復蘇后腦保護的作用研究中，抑制ROSC后神經元自噬，可減少神經元凋亡、改善神經功能也得到證實[18]。此外，在烏司他丁、核糖核酸酶（RNase）、松屬素（Pinocembrin）等對心臟驟停后神經功能的影響的相關研究中發現，降低自噬水平，可改善神經功能評分、提高記憶和學習能力[19-20]。

5 小結與展望

自噬是生物體高度保守進化的生理機制，主要維持細胞和機體的穩態作用，在應激條件下發揮著重要的調節作用。自噬在心臟驟停-?心肺復蘇中，參與腦損傷的過程，其過程復雜，機制尚不明確。在生理狀態下，自噬處于較低水平，可作為機體的一種自我修復機制。在心臟驟停-?心肺復蘇的腦損傷中，初始階段自噬被激活，能夠清除或者抑制神經元損傷相關物質，或者激活腦保護機制，從而達到神經保護作用。相反，過度激活自噬，可能促發神經元非凋亡程序性死亡，從而導致神經元凋亡與神經功能損傷。可見，在心臟驟停-?心肺復蘇中發生自噬與過度自噬，其作用截然相反，發生這種現象可能與動物模型的年齡、造模方法、腦損傷時間以及觀察相關指標的時間不同有關。因此，自噬在同一種疾病中發揮的作用機制也不相同。在心臟驟停-?心肺復蘇腦損傷中，自噬通常為大自噬，其自噬的發生主要依賴mTOR通路，也有部分依賴非mTOR通路，其介導的信號通路和參與的蛋白種類多，機制復雜。因此，需要對心肺復蘇腦損傷中自噬的機制和信號通路進一步研究，期望可以通過對自噬進行調控，從而降低心臟驟停后患者的致殘率、死亡率，改善幸存者的神經功能與生存質量，使自噬在不影響其他生命活動的同時發揮良好的神經保護作用。